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.2004年7月28日；24(30):6650-8.
doi:10.1523/JNEUROSCI.0010-04.2004。

细胞膜上G蛋白偶联受体配体对Trk神经营养素受体的反激活

里奇威·拉贾戈帕尔 1, 陈哲余, 弗朗西斯·S·李, 摩西五世·赵
附属公司

细胞膜上G蛋白偶联受体配体对Trk神经营养素受体的反激活

里奇威·拉贾戈帕尔等。 神经科学. .

摘要

神经营养素，如NGF和BDNF，通过细胞表面的受体二聚化、自噬磷酸化和细胞内信号传导激活Trk受体酪氨酸激酶。已经表明，Trk受体酪氨酸激酶的激活也可以通过G蛋白偶联受体（GPCR）机制发生，而不涉及神经营养因子。两种GPCR配体腺苷和垂体腺苷酸环化酶激活肽（PACAP）可以通过刺激Akt活性激活Trk受体活性，提高神经细胞的存活率。为了研究Trk受体反式激活的机制，我们检测了腺苷激动剂和PACAP治疗后Trk受体在PC12细胞和初级神经元中的定位。与神经营养素治疗相比，Trk受体对转录和翻译抑制剂敏感，它们主要存在于细胞内位置，尤其是与高尔基体膜相关的位置。生物素化和免疫染色实验证实，大多数反式激活的Trk受体存在于细胞膜中。这些结果表明，在细胞表面没有神经营养素结合的情况下，存在激活Trk受体酪氨酸激酶的替代模式，受体信号可能在神经元细胞内发生并持续存在。

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数字

图1。
图1。
腺苷激活多个磷酸酪氨酸残基的TrkA受体。A类，用10μ米腺苷的指定时间。使用pan-Trk抗体从细胞裂解物中免疫沉淀Trk。用大鼠TrkA的磷酸酪氨酸499抗体[pTrk 490（细胞信号）]或大鼠Trk A的磷酸酪氨酸683和684抗体[pTrk 674/675（细胞信号化）]评估Trk的磷酸化。使用带有pan-Trk抗体（B3）的免疫印迹以确保负载均匀。B类，PC12细胞用20μg/ml环己酰亚胺或200 ng/ml放线菌素D预处理30分钟，然后用10米CGS 21680作用1或3小时。从细胞裂解物中免疫沉淀Trk，并用磷酸酪氨酸抗体进行分析。通过pan-Trk抗血清的印迹法测定Trk蛋白水平。C类，定量CGS 21680处理的PC12-615细胞裂解液中的磷酸化Trk和总Trk水平。使用ImageJ分析软件对三个独立实验进行量化。与未经处理的对照组相比，色带强度水平显示在年-轴。误差线反映SEM。D类对从未经处理的PC12细胞或经10n处理的细胞中提取的总RNA进行NGF mRNA的RT-PCR米CGS 21680持续3小时。从成年大鼠颌下腺提取RNA作为阳性对照；GAPDH被用作内部负荷控制。
图2。
图2。
细胞表面未检测到反式激活的Trk受体。A类，显示了生物素化过程的示意图。按照材料和方法中的描述对PC12细胞进行生物素化，然后用10 n米CGS 21680用于指定的时间或与100 ng/ml NGF混合10分钟。制备细胞裂解物并将其分为两等份。一半的裂解物用链霉亲和素琼脂糖进行免疫沉淀，另一半用pan-Trk抗体进行免疫沉淀。B类用磷酸酪氨酸抗体和pan-Trk抗体进行印迹分析免疫沉淀物。
图3。
图3。
TrkA在内膜上被反式激活。A类，如材料和方法中所述进行受体插入测定，如示意图所示。用生物素化阻滞试剂S-NHS-醋酸盐处理PC12细胞，然后用10n或10n处理米CGS 21680或100 ng/ml NGF 3小时。细胞裂解物用鸟苷-淀粉免疫沉淀。随后用pan-Trk抗体对缺乏生物素化物质的亲和素-淀粉免疫沉淀上清液进行免疫沉淀。B类用磷酸化酪氨酸抗体、磷酸化Trk抗体或pan-Trk抗体进行印迹分析免疫沉淀物。未经处理的细胞在阻滞后（1区）或阻滞后3小时（2区）立即生物素化，作为基础水平的对照。
图4。
图4。
磷酸化TrkA抗体的特异性。根据《材料和方法》中的描述，对含有酪氨酸794的大鼠TrkA C末端区域的短肽产生的多克隆抗体进行亲和纯化，酪氨酸对NGF的反应是磷酸化的（Loeb等人，1994年）。为了评估纯化抗体的特异性，从用50 ng/ml NGF处理10分钟的PC12细胞中获得的裂解物（每个孔40μg）用亲和纯化血清以及用磷酸化或非磷酸化TrkA肽竞争物预培养的纯化血清进行探测。
图5。
图5。
反式激活TrkA受体的定位。用共焦显微镜观察反式激活TrkA在PC12细胞中的亚细胞定位。A类，用10n处理细胞米CGS 21680作用3小时或与100 ng/ml NGF作用5分钟，然后双重标记磷酸化TrkA（兔多克隆pTrkA；FITC-标记山羊抗兔）和pan-Trk（单克隆Trk B3；Cy3-山羊抗鼠）。B类为了进一步确定反式激活事件的具体位置，使用针对EEA-1、GM130或TGN-38（红色）和磷酸化TrkA（绿色）的抗体对CGS 21680处理的细胞进行双重标记。
图6。
图6。
高尔基体参与Trk转录激活。A类，PC12细胞用5μg/ml布雷菲尔丁A或载体预处理30分钟，然后用CGS 21680或NGF处理。在所有布雷费尔丁A治疗的病例中，细胞暴露于该药物的总时间为3.5小时。然后用磷酸酪氨酸或pan-Trk抗体进行印迹分析Trk免疫沉淀物。Akt的磷酸化通过用磷酸化Akt或抗Akt抗体印迹细胞裂解物来检测活化Akt和总Akt水平。B类，用brefeldin A或载体预处理的PC12细胞用10 n米CGS 21680持续3小时或100 ng/ml NGF持续5分钟，然后对pTrkA（绿色）或总Trk（红色）进行染色，并通过标准免疫荧光显微镜成像。用DAPI观察细胞核。
图7。
图7。
反式激活TrkA在基底前脑神经元中的定位。间接免疫荧光分析用于检测反式激活TrkA在原代基底前脑神经元培养物中的定位。按照指示用PACAP38处理培养物，并用磷酸化TrkA（绿色）和pan-Trk（红色）抗体标记。如有指示，K-252a（100 n米)或布雷费尔德素A（5μg/ml）在加入PACAP38之前用于预处理细胞。细胞核用DAPI（蓝色）染色。
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