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.2004年8月；14(8):1594-602.
doi:10.1101/gr.2408304。 Epub 2004年7月15日。

染色质绝缘体蛋白CTCF与全基因组DNA无甲基化结构域的结合位点

里图帕纳·穆霍帕迪耶 1, 于文强, 乔安妮·怀特黑德, 徐俊旺, 马格达·莱兹卡诺, Svetlana包, Chandrasekhar Kanduri公司, 米娜·坎杜里, 瓦苏提娃·金贾拉, 亚历山大·沃斯特罗夫, 沃尔夫冈·基茨克, 伊戈尔·切尔努金, 埃琳娜·克莱诺娃, 维克托·洛巴连科夫, 罗尔夫·奥斯森
附属公司

染色质绝缘体蛋白CTCF与全基因组DNA无甲基化结构域的结合位点

Rituparna Mukhopadhyay公司等。 基因组研究. 2004年8月.

摘要

所有已知的脊椎动物染色质绝缘体与高度保守的多价11-锌指核因子CTCF相互作用，通过以位置依赖的方式阻断增强子或沉默信号来划分表达域。最近的观察表明，CTCF的特性包括读取和传播差异甲基化H19印迹控制区的表观遗传状态。为了评估这些发现是否反映了CTCF靶点的普遍作用，我们通过生成染色质免疫纯化（ChIP）DNA克隆的DNA微阵列，然后进行ChIP-on-ChIP杂交分析，确定了200多个新的CTCF靶标位点。目标位点不仅包括参与代谢、神经发生、生长、凋亡和信号传递等多种细胞功能的已知位点，还可能包括异色序列。使用一种新的绝缘体捕获实验，我们还表明，大多数这些目标表现出绝缘体功能，具有连续的严格分布。由于通过抗5-甲基胞苷和甲基结合蛋白（MBD2）的抗体测定，这些靶标通常不含DNA甲基化，因此基于CTCF的网络与全基因组表观遗传状态相关。

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数字

图1
图1
CTCF目标站点库的特征描述。(一个)通过带移分析确定，小鼠胎肝CTCF靶向库的大部分与体外CTCF相互作用。车道1描述了从库中切下的插入物，用NotI作为探针，没有蛋白质；车道2显示重组CTCF的带移。通过包括100倍摩尔过量的冷量来确定带移的特异性H19型ICR作为竞争对手（车道三). (B类)用9个随机挑选的单个克隆进行带移分析。前八个克隆为阳性，而克隆1006为阴性。-和+符号分别表示不存在和存在重组CTCF。(C类)CTCF靶向库的微阵列分析。发件人左边到正确的图中显示了使用寡核苷酸杂交探针的总DNA估算、体内（使用小鼠胎肝的ChIP DNA）和体外（使用重组CTCF）相互作用的模式。每个克隆由四个相邻的点表示，这些点在每个微阵列上重复打印。(D类)对于五个随机选择的序列，ChIP DNA的随机扩增是无偏的。前五道显示基因组DNA浓度，以确定PCR扩增是在半定量条件下进行的。(E类)两个独立ChIP-on-ChIP杂交实验的比较。(F类)如图所示，体内/体外结合模式的定量散点图分布在不同类别的序列上。红线表示基于10个最高值的体内/体外CTCF结合效率估计值。
图2
图2
小鼠肺成纤维细胞CTCF和HP1β的免疫荧光分析。使用兔抗CTCF和山羊抗HP1β抗体进行双重免疫染色后，发现细胞核（DAPI）内的CTCF（Cy-3）和HP1β（FITC）簇呈团簇状。放大倍数×1000。发件人左边到正确的，图像显示合并的CTCF/HP1/DAPI、CTCF（红色）、HP1（绿色）、DAPI（蓝色）。
图3
图3
CTCF靶点位置的描述显示出显著的体内结合。围绕每个靶点显示一个300-kb的窗口（红色箭头），用于选择基因座，包括在肿瘤发生中具有已知功能的基因座。表1和补充材料中描述了其他基因座。
图4
图4
绝缘体陷阱分析。(一个)经典绝缘子研究中使用的各种结构的示意图。符号在底部面板的。每个结构都与其在增强子阻断分析中的性能相关，该分析根据RNA输入和外显子拷贝数进行标准化。pREPH19A结构的SV40增强子驱动的表达被赋值为100，而所有其他样本都相对于该值进行了标准化。对于每个向量构造，显示了三个不同实验的平均偏差。(B类)不同pREPtox矢量的示意图。证书圈：SV40增强器的位置。绿色方块：H19型发起人。粉红色和红色方块：克隆的不同插入物（由其原始编号表示）和H19型分别为ICR。存活克隆的数量通过菌落计数分析进行估算。(C类)毒素A分析策略概述及其在CTCF靶向库微阵列分析中的应用。(D类)与输入库序列杂交、亲和纯化（与重组CTCF）CTCF靶位点以及选择具有增强子阻断特性的克隆的示例。(E类)介绍了通过微阵列分析确定的绝缘体强度散点图分析和体外结合模式，并将其分解为CTCF库的不同序列类别。(F类)显示了通过寡核苷酸杂交确定的绝缘体/体外结合比率与微阵列相应斑点的DNA含量之间的散点图分析。
图5
图5
CTCF占用率的交叉参考甲基化状态。(一个)表明抗5-甲基胞苷的抗体仅能纯化甲基化的父本H19型如果母体遗传的等位基因是野生型，则为ICR等位基因。相反，当突变H19型ICR等位基因是母系遗传的（标记为142*，在体内无法与CTCF相互作用，同时显示大量从头甲基化；Pant等人2003年），这两个等位基因都是通过使用横跨CTCF靶位点#3和诊断EcoRV位点的PCR引物来确定的（Pant等人，2003年）。(B、 C)比较CTCF体内占有率/绝缘体强度与单个CpG甲基化的散点图分析(B类使用甲基化胞苷抗体）并聚集(C类使用抗小鼠胎肝MBD2）CpG甲基化状态的抗体。
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网站参考

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    1. www.geneontology.org; 基因本体数据库。
    1. http://bioinfo.pbi.nrc.ca:8090/EMBOSS/index.html; EMBOSS序列分析套件。

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