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.2004年7月；24(13):5863-74.
doi:10.1128/MCB.24.13.5863-5874.2004。

核支架蛋白NIPP1对早期胚胎发育和细胞增殖至关重要

阿莱德·范·伊恩德 1, 梅克·努伊滕, 梅克·德韦尔钦, 吕克·肖扬斯（Luc Schoonjans）, 斯特凡·基彭斯, 莫妮克·贝伦斯, Lieve Moons公司, 皮特·卡梅里特, 威利·斯塔曼斯, 马修·博伦
附属公司

核支架蛋白NIPP1对早期胚胎发育和细胞增殖至关重要

阿莱德·范·伊恩德等。 分子细胞生物学. 2004年7月.

摘要

NIPP1（蛋白磷酸酶核抑制剂1）是一种普遍表达的核支架蛋白，参与转录和RNA处理。其蛋白质配体包括一个蛋白激酶、一个蛋白磷酸酶、两个剪接因子和一个转录调节因子，这些蛋白质与NIPP1的结合受到磷酸化的严格调控。为了研究NIPP1在体内的功能，我们使用同源重组产生NIPP1缺陷小鼠。NIPP1（-/+）小鼠发育正常。然而，NIPP1（-/-）胚胎在胚胎第6.5天（E6.5）表现出严重的生长迟缓，并被E8.5吸收。这种早期胚胎致死性与细胞凋亡增加无关，但与细胞增殖受损有关。囊胚生长实验和培养细胞中NIPP1的RNA干扰介导的敲除也揭示了NIPP1在细胞增殖中的重要作用。与此功能进一步一致的是，通过从NIPP1（-/+）杂交囊胚中衍生胚胎干细胞或通过在高浓度Geneticin下对杂合子ES细胞进行强制匀浆，未获得活的NIPP1细胞系。我们得出结论，NIPP1对早期胚胎发育和细胞增殖是不可或缺的。

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图1。
图1。
NIPP1基因的靶向破坏。（A） 的部分限制映射第1页第8页位点（小鼠NIPP1基因）、靶向载体和靶向位点。顶部显示了从129SvJ小鼠λ基因组文库中分离出的两个12.5-kb噬菌体基因组克隆。在野生型（wt）基因座中，外显子1至5（E1至E5）显示为实心框，“ATG”代表第一个编码外显子。限制场所：B、BamHI（未全部注明）；E、 EcoRI（所有指示）；P、 PstI（并非全部显示）。wt位点和靶向载体之间的虚线描绘了基因组位点和替换载体共同的区域。新霉素耐药盒（Neo第页)在替换向量的两侧是液氧磷（未指明），胸苷激酶盒（TK）位于替代载体侧翼2的下游。目标位点代表与替换载体同源重组后NIPP1位点的预测结构。包含部分启动子区域以及外显子1至2的6.6-kb片段已被Neo盒所取代。（B） NIPP1杂合子杂交新生儿的Southern blot基因分型。基因组DNA用EcoRI酶切并与探针A杂交，wt等位基因产生9-kb带，突变等位基因形成5.8kb带。（C） NIPP1杂合子杂交获得的E7.5胚胎的PCR基因分型。如材料和方法中所述，wt特异性巢式PCR扩增出402 bp的带，而突变特异性PCR扩增出696 bp的带。M、 标记；C、 控件。（D） NIPP1杂合杂交分离的囊胚（E3.5）的RT-PCR基因分型。wt NIPP1等位基因的存在导致350-bp片段，而突变的NIPP1等位基因导致696-bp产物的扩增。（E） 通过免疫染色检测NIPP1杂合子杂交E6.5胚胎中的NIPP1。用E6.5蜕膜制作石蜡包埋胚胎的连续横切面。切片用抗NIPP1抗体（a和c）或抗HDAC2抗体（b和d）染色。图中显示了一个表达NIPP1（a和b）的胚胎和一个缺乏NIPP1的胚胎（c和d）。面板c和d中的对照条件不包含DNA模板。面板Ea中的钢筋，50μm。
图2。
图2。
E6.5 NIPP1的组织学分析重量和NIPP1−/−同窝的人。图中显示了嵌有石蜡的NIPP1的苏木精和伊红染色切片重量（A至C）和NIPP1−/−（D至F）胚胎在E6.5。NIPP1公司重量指NIPP1+/+或NIPP1−/+基因型。图中显示了胚胎外（B和E）和胚胎（C和F）两极的横截面以及矢状截面（A和D）。面板A中的箭头表示胚胎和胚外区域之间的连接。NIPP1公司−/−胚胎的大小约为野生型同胞的一半。无法区分外胎盘锥。Ec，外胎盘锥；ExEc，胚外外胚层，ExVE，胚外脏内胚层；EmEc，胚胎外胚层；胚胎内脏内胚层；R、 Reichert膜；PrC，羊膜前腔。面板A中的棒材，50μm。
图3。
图3。
NIPP1中的细胞谱系重量和NIPP1−/−胚胎。嵌蜡NIPP1的横截面（A）和矢状截面（B）重量和NIPP1−/−如图所示，对胚胎（E6.5）进行NIPP1、Gata4、Cdx2和Oct4免疫染色。Gata4特异性染色内脏和壁内胚层，Cdx2是胚外外胚层的标记，Oct4在胚胎外胚层中特异性表达。NIPP1中可以区分所有三种细胞系−/−胚胎，但胚外胚层和胚胎外胚层没有组织成透明的上皮层。缩写如图2图例所示。VE，内脏内胚层。面板Aa和Ba中的棒材，50μm。
图4。
图4。
NIPP1的细胞凋亡和增殖率重量和NIPP1−/−胚胎。（A） NIPP1嵌蜡横截面重量（a和b）和NIPP1−/−（c和d）E6.5胚胎用苏木精和伊红染色（a和c），并用TUNEL分析（b和d）显示凋亡。野生型和敲除型胚胎的细胞凋亡没有差异。面板Aa中的钢筋，50μm。（B） 在处死前1小时向怀孕小鼠注射BrdU。NIPP1部分重量和NIPP1−/−用抗BrdU抗体进行免疫染色，对胚胎（E6.5）进行BrdU掺入分析。五个NIPP1的染色细胞核重量和六个NIPP1−/−对胚胎进行计数，并将其表示为切片中细胞核总数的百分比。在突变胚胎中发现近20%的BrdU掺入量降低，表明细胞增殖率降低。结果为平均值±标准误差(P（P）=0.0074（未配对）t吨测试）。
图5：。
图5：。
NIPP1缺陷囊胚生长迟缓。按照材料和方法中的描述，分离、培养杂合子杂交后代的囊胚并进行基因分型。（A） NIPP1的副产物照片重量（a至c）和NIPP1−/−（d至f）囊胚在体外培养指定时间后。3至5天后，内细胞团（ICM）被滋养层巨细胞（TG）包围。3天后，NIPP1−/−胚泡尚未形成突起。ZP，透明带。（B） 培养4天后，NIPP1重量和NIPP1−/−用BrdU孵育囊胚外生长16h。通过BrdU免疫荧光（b和e）观察BrdU掺入。图中还显示了通过免疫荧光（a和d）和Hoechst染色（e和f）对NIPP1和DNA的囊胚生长进行染色。NIPP1公司−/−囊胚发育延迟，BrdU掺入严重减少。抗体。棒材，20μm。
图6。
图6。
RNAi介导的NIPP1敲低对哺乳动物细胞增殖的影响。（A） 用NIPP1特异性或层粘连A/C特异性siRNA或模拟转染（无siRNA）转染HEK293细胞72小时后，用抗NIPP1抗体（上面板）和抗SIPP1抗体进行免疫印迹分析，SIPP1是一种结构无关的核支架蛋白（下面板）。（B） 通过免疫荧光分析测定模拟转染细胞（a）和转染NIPP1特异性siRNAs（B）的细胞中NIPP1蛋白的水平。棒材，10μm。（C） 模拟转染（a）或转染NIPP1-特异性siRNAs（b）72小时后HEK293细胞的数量和形态。RNAi诱导的NIPP1基因敲除导致细胞数量减少，表明生长较慢。棒材，30μm。
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