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.2004年7月；24(13):5776-87.
doi:10.1128/MCB.24.13.5776-5787.2004。

需要结构特异性内切酶Ercc1-Xpf来解决DNA链间交联诱导的双链断裂

劳拉·尼德恩霍夫 1, 汉尼·奥迪克, 马格达·布佐夫斯卡, 埃伦·范·德鲁宁, 亚历克斯·马斯, 阿尔扬·F·泰尔, 简·德维特, N G J贾斯珀斯, H伯纳·贝弗卢, Jan H J Hoeijmakers公司, 罗兰·卡纳尔
附属公司

需要结构特异性内切酶Ercc1-Xpf来解决DNA链间交联诱导的双链断裂

劳拉·尼德恩霍夫等。 分子细胞生物学. 2004年7月.

摘要

链间交联（ICLs）是一类在正常代谢或癌症化疗过程中发生的毒性极强的DNA损伤。ICL共价连接双链DNA的两条链，防止对聚合酶通路至关重要的链解链。哺乳动物细胞中ICL修复的机制尚不清楚。然而，遗传数据表明Ercc1-Xpf内切酶和同源重组介导的双链断裂（DSB）修复所需的蛋白质。为了研究Ercc1-Xpf在ICL修复中的作用，我们监测组蛋白变体H2AX（gamma-H2AX）的磷酸化。磷酸蛋白在DSB聚集，形成可通过免疫染色检测到的病灶。用丝裂霉素C（MMC）处理野生型细胞可诱导γ-H2AX病灶，并增加脉冲场凝胶电泳检测到的DSB数量。令人惊讶的是，MMC处理也在Ercc1（-/-）细胞中诱导了γ-H2AX病灶。因此，DSB通过Ercc1独立机制发生在交叉链路损坏之后。相反，ICL诱导的DSB形成需要细胞周期进展到S期，这表明DSB是DNA复制过程中形成的ICL修复的中间产物。在Ercc1（-/-）细胞中，MMC诱导的γ-H2AX病灶持续时间比野生型细胞至少长48小时，这表明Ercc1是解决交联诱导的DSB所必需的。MMC在野生型细胞中触发姊妹染色单体交换，但在Ercc1（-/-）和Xpf突变细胞中触发染色单体融合，这表明在没有它们的情况下，DSB的修复被阻止。总之，这些数据支持Ercc1-Xpf在处理ICL诱导的DSB中的作用，以便这些细胞毒性中间产物可以通过同源重组修复。

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图1。
图1。
DNA损伤后野生型细胞中的γ-H2AX病灶。（A） 以低细胞密度将早期野生型（wt）初级MEF接种在玻璃盖玻片上。16 h后，将细胞暴露于10 Gyγ射线或3μM MMC中1 h，然后在37°C下进一步培养。10小时后，固定细胞并进行γ-H2AX免疫染色。（B） 将野生型小鼠ES细胞接种在涂有明胶的玻璃盖玻片上，并在暴露于UV-C（254 nm，10 J/m2)或3μM MMC培养1 h。细胞再培养14 h，然后按照面板A所述进行固定和处理。（C）细胞暴露于增加浓度的MMC后γ-H2AX病灶的定量。接种在玻璃盖玻片上的早期野生型初级MEF暴露于不同浓度的MMC中1 h，然后在新鲜培养基中培养12 h，然后固定和免疫染色γ-H2AX。对于每个数据点，检查了100多个细胞核，计算了γ-H2AX病灶，并将细胞分类为每个细胞核有零个、一到两个或两个以上病灶。将绘制每个类别中的单元格百分比。（D） 野生型细胞暴露于3μM MMC后不同时间点γ-H2AX焦点形成的定量。误差条表示从三个以上的单独实验中收集数据时平均值的标准误差。
图2。
图2。
γ-H2AX焦点错误代码1−/−DNA损伤后的细胞。（A） 提前通过错误代码1−/−如图1所示，将初级MEF接种在玻璃上。用10 Gyγ射线（与野生型细胞相当的剂量）或1μM MMC（与野生类型细胞相当的毒性）照射1 h，可诱导DNA损伤。（B）错误代码1−/−如图1所示，将ES细胞接种在玻璃上。10 J/m的UV-C诱导DNA损伤2（对野生型细胞的等效剂量）、300 nM MMC或3.3μM顺铂（对野生型细胞的等效剂量）持续1小时。（C）暴露于错误代码1−/−MEF至1μM MMC。误差条表示从三个以上的单独实验中收集数据点时平均值的标准误差。（D） 暴露后不同时间γ-H2AX焦点形成的定量Xpa公司−/−MEF至1μM MMC。（E） 脉冲场凝胶电泳检测DSB。野生型（wt）和错误代码1−/−ES细胞用7.2μM MMC处理1小时，洗涤，并在新鲜培养基中再孵育0至48小时。5×10插头6为每个时间点准备细胞，并通过电泳分析低分子量DNA，以指示基因组DSB。葡萄裂殖酵母在lane MW中，染色体被用作分子大小标记。
图3。
图3。
细胞周期、交联损伤和γ-H2AX病灶形成之间的关系。（A） 暴露G后γ-H2AX焦点形成1-逮捕野生型（wt）MEF至MMC。将早期野生型MEF以非常高的密度播种在玻璃盖玻片上，以便通过接触抑制来阻止它们。48小时后，将细胞暴露于3μM MMC中1小时。在暴露后的指定时间，固定细胞并进行γ-H2AX免疫染色。12小时样品一式两份。第二个复制品在暴露于MMC后12小时进行胰蛋白酶消化，以1:10的比例分离以释放接触抑制细胞，并重新接种在玻璃盖玻片上。细胞在上述（B）所示和分析的时间重新放置后固定。（C） 交联损伤前后野生型ES细胞的FACS图谱。野生型ES细胞的基因组DNA用碘化丙啶染色，并用FACS定量，如材料和方法所述。未经处理的细胞直接固定和染色。处理后的细胞暴露于3μM MMC中1 h，再孵育12 h，收获、固定并染色。G1（2n DNA含量）和G2/每个剖面上方显示了细胞的M（4n）部分。（D） 野生型和错误代码1−/−交联损伤前后的ES细胞。按照面板C所述处理细胞。使用等毒性浓度的MMC（野生型细胞为3μM，野生型细胞0.3μM）错误代码1−/−单元格）。G中细胞的比例1、S和G2/M是根据FACS剖面确定的，并绘制为总量的百分比。（E） 野生型和错误代码1−/−交联损伤前后的原代成纤维细胞。除用于错误代码1−/−MEFs为1μM。
图4。
图4。
交联损伤细胞染色体畸变分析。将野生型（wt）和突变细胞的亚流培养物暴露于等毒性浓度的MMC或顺铂中1 h，洗涤两次，然后在每ml含有10μg BrdU的培养基中再培养24 h。胰蛋白酶化前30分钟，添加秋水仙素。（A） MMC处理的野生型ES细胞的中期扩散，显示姐妹染色单体染色不均，表明存在BrdU时有两轮DNA复制。姐妹染色单体交换（箭头）是频繁的，但其他畸变明显不存在。（B） MMC治疗后的中期扩散错误代码1−/−ES细胞。畸变，包括间隙、断裂和放射状，在突变细胞中很常见。姐妹染色单体之间的融合（用箭头表示）是最丰富的畸变。（C） MMC处理的扩散错误代码1−/−ES细胞，表现出后期桥接（箭头）和微核（星号），分别是染色单体不分离和断裂的标志。此外，细胞核大小变化很大，表明细胞核DNA含量的变化。（D） 顺铂处理的野生型CHO细胞的代表性扩散，显示姐妹染色单体交换频繁（箭头所示）。（E） 中期传播Xpf公司用顺铂处理突变CHO细胞。染色显示自药物治疗以来只有一轮复制，染色单体融合丰富（箭头）。（F） 顺铂治疗的中期扩散错误代码1突变CHO细胞，也有大量融合（箭头）。（G）错误代码1顺铂治疗后突变CHO细胞，具有后期桥接（箭头）和微核（星号）。
图5：。
图5：。
哺乳动物细胞DNA ICL修复机制的模型。DNA的两条链及其极性用黑色表示，垂直线代表碱基对。DNA ICL被描述为连接两条链的红线。新复制的DNA用箭头表示，为了清楚起见，模板和新合成的DNA链之间没有碱基配对。（A） ICL的修复在DNA复制过程中启动。（B） ICL阻止了两条DNA链的解开，从而使复制分支停滞。（C）这导致分支回归，并以与Ercc1-Xpf无关的方式形成DSB。通过免疫染色可以检测到DSB是γ-H2AX的局部积聚。（D） DSB的形成通过在ICL附近显示3′端，为模板DNA中的内切酶Ercc1-Xpf创建底物。（E） Ercc1-Xpf具有其特有的底物特异性（用剪刀表示）。切口从两条DNA链中的一条释放ICL。（F） 残留的DNA损伤可以通过能够跨损伤合成的DNA聚合酶绕过（用金表示）。（G） 可能是残余的ICL损伤最终从第二条链上消除（潜在的切割位置用箭头表示）。（H） 由此产生的差距可以通过复制机器来填补。（I） DSB的修复需要切除断端，以显示3′单股悬垂。（J） 这个3′端侵入模板DNA，形成一个联合分子。这只有在Ercc1-Xpf切割阻塞ICL后才可能实现。（K） 异源双工的扩展可以重新建立复制分叉。
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