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.2004年8月15日；382（第1部分）：27-32。
doi:10.1042/BJ20040487。

谷氨酰胺有效性上调HepG2细胞中氨基酸转运蛋白ASCT2的表达并刺激ASCT2启动子

克莱尔·本加德 1, 约翰·D·麦基文
附属公司

谷氨酰胺利用率上调HepG2细胞中氨基酸转运蛋白ASCT2的表达并刺激ASCT2启动子

克莱尔·邦加德等。 生物化学杂志. .

摘要

谷氨酰胺转运到人肝癌细胞系HepG2主要由ASCT2型转运体催化，该转运体与先前从JAR细胞克隆的转运体序列相同。抗ASCT2蛋白C末端的抗体在蛋白质印迹上显示可以识别ASCT2。使用该抗体，发现细胞生长速度的变化不会影响ASCT2的表达，但谷氨酰胺剥夺会显著降低生长速度和ASCT2表达。许多其他蛋白质的表达在这些条件下不受影响。ASCT2基因5’侧翼区域的序列来自人类基因组数据库。该序列的907 bp片段被定向连接到荧光素酶报告载体中，并在转染HepG2细胞时显示出启动子活性。当在不含谷氨酰胺的培养基中进行转染时，启动子活性大大降低，而当转染后加入谷氨酰胺时，启动子活性恢复。其他必需氨基酸的缺乏不会影响启动子活性，谷氨酰胺缺乏不会影响MCT1（单羧酸转运体1）启动子。这些结果表明，ASCT2启动子活性和ASCT2蛋白在这些细胞中的表达都依赖于谷氨酰胺的可用性。

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数字

图1
图1。抗体特异性
(一)用抗ASCT2抗体探测的细胞提取物的代表性蛋白质印迹。泳道a，HepG2细胞；b道，未转染COS细胞；lane c，转染后24小时COS细胞；车道d，转染后48小时COS细胞。箭头指示感兴趣的波段。分子量大小在印迹左侧以kDa表示。(B类)印迹显示HepG2细胞提取物中ASCT2带的肽被阻断。通道a，对照（25μg细胞提取物）；通道b，对照（35μg细胞提取物）；lane c，blot为lane a，用10μg/ml免疫原性肽封闭；用10μg/ml免疫原性肽封闭lane d，blot为lane b。
图2
图2。培养基对细胞生长速度的影响
细胞在大约10时播种5细胞/孔在正常培养基中培养24小时。然后将培养基更换为对照培养基(♦), 添加0.1μM PMA的培养基(▪), 添加0.1 mM新生霉素（×）的培养基或缺乏谷氨酰胺的培养基，但与对照培养基（▴）相同。在更换培养基后的24、48和72小时，将细胞胰蛋白酶化，悬浮在1 ml培养基中并计数。结果为平均值±S。四次测定的E.M。
图3
图3。Western blot显示在图2所示条件下生长的HepG2细胞中ASCT2水平
(一)代表性印迹。车道m，分子质量标记（以kDa为单位的大小显示在印迹左侧）；车道a，控制介质；车道b，中等+PMA；lanes c，无谷氨酰胺培养基；车道d，中等+新生霉素。在每种情况下，使用35μg细胞提取物。(B类)四个独立实验中ASCT2谱带的相对强度与上述使用Imagequant估算的结果类似。对照培养基中细胞的平均值为1，结果为平均值±S。E.M.A，对照介质；B、 培养基+PMA；C、 无谷氨酰胺培养基；D、 培养基+新生霉素。
图4
图4。添加谷氨酰胺后ASCT2蛋白表达的时间进程
HepG2细胞最初在无谷氨酰胺培养基中培养7天。随后，添加谷氨酰胺（5 mM），并通过Western blotting分析30μg细胞提取物样品，如上图3所示。ASCT2蛋白含量在零时间的值取1，其他时间点的值与此相关。结果为平均值±S。四次测定的E.M。在单独的实验中，在标准含谷氨酰胺培养基中培养至少7天的细胞中，ASCT2表达的相对值为4.5。♦, 无抑制剂；▴, +10μg/ml放线菌素D；▪, +10μg/ml环己酰亚胺。
图5
图5。谷氨酰胺利用率对蛋白质表达的影响
HepG2细胞在有无谷氨酰胺的条件下生长。然后用抗ASCT2（A）、钙网蛋白（B）或谷氨酸脱氢酶（C）抗体检测细胞蛋白的三个重复印迹。整个实验在四种不同的细胞培养物上重复进行；使用Imagequant对条带进行量化。对于每种抗体，在存在谷氨酰胺的情况下，细胞带的平均强度分别设置为1。开条，存在谷氨酰胺；阴影条，谷氨酰胺缺乏。
图6
图6。人类启动子区ASCT2型基因
人类ASCT2型如文中所述，基因来自人类基因组数据库。↓ 显示了已发表的cDNA序列的5′端[9]↓显示了预测的转录起始位点，其被指定为核苷酸0。TATA框（下划线）和通常参与肝脏基因表达的转录因子的假定共识结合位点以粗体显示。AARE，氨基酸反应元件；肝细胞核因子；NF，核因子。
图7
图7。转染pGL3-basic启动子的HepG2细胞提取物中荧光素酶的活性
用pGL3构建物和pRL-CMV载体联合转染HepG2细胞，并在不同培养基中生长。A、 零时间转染细胞，无谷氨酰胺培养；B、 细胞在零时间转染并在谷氨酰胺存在下生长；C、 零时间转染细胞，在不含谷氨酰胺的情况下生长24h，然后添加谷氨酰胺，再生长24h；D、 细胞在零时间转染，在无谷氨酰胺的情况下生长24小时，然后用5 mM谷氨酸再生长24小时。结果为平均值±S。六个单独转染实验的E.M.，表示为萤火虫发光与雷尼利亚发光。转染后24小时（开条）和48小时（阴影条）测定启动子活性。
图8
图8。pGL3-basic载体转染HepG2细胞在不同培养基中的荧光素酶活性
用pGL3构建物和pRL-CMV载体在不同培养基中共同转染细胞，并在相同培养基中培养48 h。在48小时的时间点读取发光读数。A、 谷氨酰胺缺乏培养基；B、 含有所有氨基酸的标准培养基；C、 缺乏亮氨酸的培养基；D、 缺乏蛋氨酸的中等。
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