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.2004年6月；164(6):1979-88.
doi:10.1016/s0002-9440（10）63758-3。

透明质酸减弱肾近端小管上皮细胞转化生长因子-β1介导的信号转导

伊藤忠文 1, 约翰·威廉姆斯, 唐纳德.弗雷泽, 亚历德·菲利普斯
附属公司

透明质酸减弱肾近端小管上皮细胞转化生长因子-β1介导的信号转导

伊藤忠文等。 美国病理学杂志. 2004年6月.

摘要

透明质酸（HA）表达增加与急性肾损伤和进展性肾脏疾病相关，但其功能意义尚不清楚。大量证据表明转化生长因子（TGF）-β1对进展性肾病的发展至关重要。最近的研究表明HA和TGF-β信号在癌细胞生物学中相互作用。本研究的目的是检测HA作为TGF-β1在肾近端小管上皮细胞（PTC）中功能调节剂的潜在作用。在静息状态下，HA、CD44的主要受体以及TGF-βI型和II型受体的共同定位通过免疫沉淀和western分析证实，并通过免疫细胞化学和共聚焦显微镜进一步证实。通过Western分析评估，TGF-β1刺激PTC导致III型和IV型胶原合成增加。HA的添加并没有改变胶原蛋白的合成，但消除了TGF-β1介导的III型和IV型胶原蛋白的增加。通过向CD44添加阻断抗体以及抑制MAP激酶（MEK）活性，可以阻断这种作用。此外，HA降低了荧光素酶-SMAD应答结构的TGF-β1激活，并减少了SMAD4向细胞核的移位。我们之前在抓伤模型中证明了TGF-β1的抗迁移作用。与HA对TGF-β1细胞外基质生成的拮抗作用一样，HA以CD44依赖的方式降低了TGF-α1的抗迁移作用。与TGF-β1对胶原合成的影响（SMAD依赖性）相反，已知TGF-贝塔1在该模型中的抗迁移作用依赖于RhoA的激活。在HA存在的情况下，TGF-β1介导的RhoA活化也以CD44依赖的方式被消除。结果表明，CD44和TGF-β受体的共同定位促进了HA对SMAD和非SMAD依赖性TGF-贝塔介导事件的调节。因此，我们的结果表明HA合成的改变可能是限制肾损伤的内源性机制。

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数字

图1
图1
CD44和TGF-β受体的共放大。答：CD44和TGF-β受体相关性的Western blot分析。从暴露于HA（分子量2×10）的血清剥夺的HK-2细胞的融合单层中提取细胞蛋白6最终浓度为25μg/ml、重组TGF-β1（10 ng/ml）或两者的组合刺激，均在无血清条件下持续48小时。随后，对TGF-β1Ⅰ型受体（IP TGF-？RI）或CD44（IP CD44）进行免疫沉淀，并用CD44（IB CD44）、TGF-αI型受体（IB TGF-。在对照实验中，细胞单独暴露于无血清培养基中48小时。B类：CD44和TGF-βI型受体的免疫细胞化学定位。在室温下用3%多聚甲醛固定15分钟之前，将HK-2细胞的汇合单层去除血清48小时，并在室温下使用0.1%Triton在PBS中渗透5分钟。CD44（绿色）和TGF-βI型受体（红色）的表达通过免疫细胞化学进行检测，并通过共焦显微镜进行分析，如材料和方法中所述，以及通过合并单个图像检查其关联性。
图2
图2
HA可防止TGF-β1介导的III型胶原增加。用TGF-β1和HA刺激血清剥夺的HK-2细胞的融合单层，如是否存在CD44阻断抗体（最终浓度5μg/ml）所示(A类)或MEK抑制剂PD98059（10μmol/L）(B类). 在添加刺激物48小时后收集上清液样品，并对等体积的上清液进行III型胶原的蛋白质印迹分析。抄送：扫描密度测定后，III型胶原的变化表现为胶原表达密度测定比率比对照组增加了倍。数据表示六个单独实验的平均值±SD。
图3
图3
HA可防止TGF-β1介导的IV型胶原增加。TGF-β1和HA刺激无血清HK-2细胞的融合单层，如是否存在CD44阻断抗体（最终浓度5μg/ml）所示(A类)或MEK抑制剂PD98059（10μmol/L）(B类). 在添加刺激物和等量上清液48小时后收集上清液样本，并进行IV型胶原的Western blot分析。抄送：扫描密度测定后，IV型胶原的变化表现为胶原表达密度测定比率比对照组增加了倍。数据表示五个单独实验的平均值±SD。
图4
图4
TGF-β1介导的拮抗增加了SMAD依赖的信号传导。答：用SMAD应答启动子（SBE）转染HK-2细胞4-Lux，在用TGF-β1（1 ng/ml）或低分子量HA（LMW-HA分子量65000）或高分子量HA（分子量2×10）刺激之前6)浓度为25μg/ml，均在无血清条件下。如图所示，TGF-β1（1 ng/ml）和增加高分子HA剂量的组合也刺激细胞。在最高剂量的高分子量HA细胞中，用TGF-β1和CD44阻断抗体（最终浓度5μg/ml）刺激HA细胞。B类：在单独的一系列实验中，TGF-β1（1 ng/ml）和高分子量HA（25μg/ml）单独、联合或与增加剂量的MEK抑制剂PD98059联合刺激HK-2细胞的血清剥夺单层。所有刺激均持续24小时。数据表示平均值±SD，n个= 9, *P（P）与单独TGF-β1相比<0.05，#P（P）在没有PD98059的情况下，与TGF-β1和HA相比<0.005。
图5
图5
SMAD4的核转位被高分子量HA减弱。随着重组TGF-β1（0，A类和天; 1纳克/毫升，B类和E类; 10ng/ml，C类和F类)要么一个人(A–C)或在25μg/ml HMW-HA存在下(E类和F类). 在单独的实验中，仅用25μg/ml HMW-HA刺激细胞(天). 通过在室温下添加3%多聚甲醛固定细胞15分钟，并在室温下施加刺激48小时后用0.1%Triton在PBS中渗透5分钟。用免疫细胞化学方法检测SMAD4的定位，并用共聚焦显微镜进行分析。
图6
图6
添加TGF-β1后伤口闭合抑制的量化。答：如材料和方法所述，HK-2细胞的汇合单层被“刮伤”。随后，添加10 ng/ml TGF-β1后的细胞迁移率(♦), 评估TGF-β1（10 ng/ml）和HMW-HA（25μg/ml）在有（△）或无（•）CD44阻断抗体的情况下的联合作用。在对照实验中，细胞单独暴露于无血清培养基中（□）。通过直接计算在所示的每个时间点迁移到交叉裸露区域的细胞数量来评估细胞迁移。B类：在创建受伤区域后的平行实验中，添加10 ng/ml TGF-β1后的细胞迁移率(♦), 在MEK抑制剂PD98059存在（△）或不存在（•）10μmol/L的情况下，评估TGF-β1（10 ng/ml）和HMW-HA（25μg/ml）的联合作用。在对照实验中，细胞单独暴露于无血清培养基中（□）。通过直接计算在所示的每个时间点迁移到交叉裸露区域的细胞数量来评估细胞迁移。数据表示三个单独实验的平均值±SD，表示为细胞数mm−2剥蚀区。P（P）在24小时后的所有时间点，TGF-β1与对照组和TGF-。P-NS TGF-β1对TGF-α1+HA+阻断CD44抗体，TGF-γ1对TGFβ1+HA+PD98059。
图7
图7
TGF-β1介导的RhoA活化的调节。答：如图所示，用重组TGF-β1（10 ng/ml）、HMW-HA（25μg/ml）或两种刺激物共同作用120分钟来刺激HK-2细胞的汇合单层。在平行实验中，用TGF-β1（10 ng/ml）、HMW-HA（25μg/ml）或联合刺激物刺激细胞，无论是否存在5μg/ml的CD44封闭抗体(B类)，或MEK抑制剂PD98059(C类)在10μmol/L的浓度下，通过GTP-RhoA免疫沉淀法评估RhoA的激活，如材料和方法中所述。医生：扫描密度测定后，RhoA的变化表现为RhoA表达的密度测定比率比对照组增加了一倍。数据表示三个单独实验的平均值±SD*P（P）与对照组和TGF-β+HA相比，<0.05。
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