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.2004年8月；15(8):3553-66.
doi:10.1091/mbc.e04-02-0147。 Epub 2004年5月21日。

Atg21是一种磷酸肌醇结合蛋白，通过选择性自噬在氨肽酶I摄取期间高效脂化和定位Atg8所需

根据E Strömhaug 1, 富尔维奥·雷吉奥里, 居冠, 王朝文, 丹尼尔·克林斯基
附属公司

Atg21是一种磷酸肌醇结合蛋白，通过选择性自噬在氨肽酶I摄取期间高效脂化和定位Atg8所需

根据E Strömhaug等。 分子生物学细胞. 2004年8月.

摘要

通过自噬和细胞质到液泡靶向（Cvt）途径将蛋白质和细胞器输送到液泡，涉及膜的新重排，导致形成与液泡融合的囊泡。囊泡的形成机制和膜的起源是一个复杂的问题，有待解决。Atg18和Atg21是囊泡形成所必需的蛋白质，与Ygr223c一起形成一个新的磷酸肌醇结合蛋白家族，与液泡和液泡周围结构相关。它们的定位需要Vps34的活性，这表明磷脂酰肌醇（3）磷酸可能对其功能至关重要。Atg18的活性对所有形式的自噬都至关重要，而Atg21是Cvt途径所必需的，但不是氮缺乏诱导的自噬者所必需的。Atg21的缺失导致自噬前结构（PAS）中缺少Atg8，这可能归因于Atg8与磷脂酰乙醇胺的结合速率降低。第二个泛素样结合物Atg12-Atg5定位的类似缺陷表明，Atg21可能参与PAS的膜招募。

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图1。
图1。
Cvt途径需要Atg21。（A）第21页Δ细胞在YPD中生长并转移到SD-N诱导自噬。这个第21页Δ细胞在饥饿条件下成熟prApe1的速度比第11天Δ，而在第18天Δ单元。（B） Pho8Δ60是一种非特异性自噬标记物，被传递到第21页Δ细胞处于氮饥饿状态。重量（TN124），第18天Δ（JGY20），以及第21页Δ（PSY107）细胞按照A中的描述生长。将细胞转移到SD-N，收集样品，并分析蛋白质提取物的碱性磷酸酶活性。野生型样本中的活性设置为100%，其他活性相对于野生型进行了标准化。这个第21页Δ结果代表三个实验的平均值和S.E.，而第18天Δ结果基于同一试验的重复样品。（C）第21页Δ和ygr223c公司Δ细胞不缺乏过氧化物酶体降解。将细胞从油酸培养基转移到SD-N，并用过氧化物酶体硫酶抗体（Fox3）通过Western blot监测pexophagy。的结果ygr223c公司Δ应变与第21页Δ. （D） Cvt囊泡形成需要Atg21。第21页Δ第四人民党将Δ（PSY2）细胞转化为球形体，并按照材料和方法中所述进行蛋白酶保护试验。
图2。
图2。
Atg21与液泡和泡前结构有关。野生型（SEY6210）细胞在ATG18型（PSY62），自动液位计21（PSY63），以及YGR223c型（PSY100）基因座，并用FM 4-64染色以标记液泡。观察前，细胞在YPD中生长至早中期对数期。驾驶员信息中心（DIC），差分干扰对比度。
图3。
图3。
Atg18、Atg21和Ygr223c定位依赖于PtdIns 3-激酶活性。表达Atg18-GFP、Atg21-GFP或Ygr223c-GFP的菌株PSY291、PSY292、PSY29.3、PSY62、PSY63、PSY100、PSY146和PSY290第34版ts秒和野生型SEY6210（A）或工厂1-2ts秒背景（B）在26°C下生长到SMD中对数期早期，并在38°C下培养10（A）或40分钟（B）。如图2图例所示，通过荧光显微镜观察细胞。在非允许温度下，PtdIns 3-激酶活性的丧失，而PtdIns（3）P5-激酶活性的缺失导致Atg18和Atg21的定位丢失。驾驶员信息中心（DIC），差分干扰对比度。
图4。
图4。
Atg21在体外与磷脂结合。（A） MBP、MBP-Atg18、MBP-Attg21和MBP-Ygr223c从大肠杆菌如材料和方法所述。将蛋白质（1μg）加载到凝胶上，并用考马斯亮蓝g对凝胶进行染色。（B）含有固定在硝化纤维素上的脂质的PIP条带（梯形）用100 ng/ml MBP、MBP-Atg18、MBP-Attg21或MBP-Ygr223c培养，如材料和方法中所述。
图5。
图5。
精氨酸343和精氨酸34.4是Atg21功能所必需的。（A）第21页表达GFP-Atg21（pPS123）但不表达GFP-Attg21的Δ细胞（PSY7）343344K兰特（pPS125）成熟prApe1。（B） GFP-附件21r343344万不局限于液泡和点状结构。驾驶员信息中心（DIC），差分干扰对比度。
图6。
图6。
Atg蛋白在PAS中的定位第21页Δ单元。（A） Atg19-CFP和Atg11-YFP在第21页Δ单元。PSY6型(第21页用表达Atg19-CFP（pCVT19CFP（414））和YFP-Atg11（pPS97）的质粒转化Δ）细胞，在SMD中对数期生长，并进行荧光显微镜分析。（B） GFP-Atg8未本地化为中的PAS第21页Δ单元。第21页Δ细胞从染色体位点表达Atg1-GFP（PSY227）或Atg14-GFP（PSY288），并在整合质粒上从内源性启动子表达RFP-prApe1，或第21页Δ第8天在观察之前，将表达GFP-Atg8（PSY226）的Δ细胞从整合质粒内源性启动子后面培养到中对数期，并在着丝粒质粒上表达内源性启动因子RFP-prApe1。Atg2-GFP的定位与Atg1-GFP的显示基本相同。（C） GFP-Atg8向液泡的转运减少第21页Δ单元。野生型（WT、SEY6210）和第21页用表达GFP-Atg8的质粒转化Δ细胞（PSY7）CUP1大学-启动子（pCuGFP-AUT7（416）），在添加1 mM苯甲基磺酰基氟化物之前，在SMD中生长到中对数期，如图所示，饥饿氮气长达8小时。DIC，差分干涉对比度。
图7。
图7。
Atg8的脂质过氧化减少第21页Δ单元。（A） 富培养基和缺氮培养基中的Atg8脂质氧化。细胞在YPD中生长至中对数早期，然后在SD-N中饥饿3 h。用含有6%尿素（Kirisako）的12%SDS-page凝胶从Atg8中分离Atg8-PE等., 2000). 所有菌株均为BY4742背景。（B） 删除自动液位计21对抗自噬突变体中Atg8-PE的积累。重量（SEY6210），第21页Δ（PSY7），第18天Δ（JGY3），第18天Δ第21页Δ（PSY167），第9天Δ（JKY007），以及第9天Δ第21页Δ（PSY191）细胞在SD-N中饥饿4h，用Western blot分析Atg8-PE。（C） 删除自动液位计21拮抗自噬突变体PAS处GFP-Atg8的积累。B中使用的含有表达GFP-Atg8质粒的菌株CUP1大学启动子在SMD中生长到中对数期，然后在SD-N中饥饿4小时第21页Δ细胞的Atg8脂质化速率降低。按照材料和方法中的描述，对BY4742背景的细胞进行标记和Atg8免疫沉淀，并用12%的SDS-面积凝胶进行分析。
图8。
图8。
负责Atg8翻译后修饰的共轭系统在第21页Δ突变。（A） Atg4能够识别Atg8并在C末端进行蛋白水解裂解。编码Atg8-GFP的质粒转化为野生型（SEY6210），第4天Δ（WPHYD2）或第21页Δ（PSY5）应变。细胞在SMD中生长至早期对数期（A600=0.6），然后在SMD中保留或在SD-N培养基中缺氮3 h。蛋白质提取物通过使用Ape1抗血清或抗GFP单克隆抗体进行Western blot分析。星号表示与抗GFP抗体交叉反应的污染带。（B） Atg7 E1-like和Atg3 E2酶能够激活和结合Atg8。按照材料和方法中的描述进行酵母双杂交分析。
图9。
图9。
PAS的Atg5-GFP累积需要Atg21。（A） 缺乏Atg8和Atg21的细胞在饥饿时不会成熟prApe1。WT（SEY6210）、单突变体（WPHYD7、WPHYD2、AHY001和PSY7）和双突变体（PSY139、PSY128和PSY190）在YPD中对数期生长，饥饿4和6小时，然后使用抗Ape1抗体进行Western blot分析。（B） Atg12到Atg5的共轭不需要Atg21。WT（PSY66）和第21页从染色体位点表达Atg5-HA的Δ（PSY155）细胞在YPD中生长至早期中对数期，并使用HA抗体进行Western blot。（C） PAS的Atg5-GFP累积需要Atg21。atg8型Δ（PSY285）和第8天Δ第21页如图6图例所示，在YPD中，从染色体位点表达Atg5-GFP的Δ（PSY286）细胞和从整合质粒表达RFP-prApe1的细胞生长到早期中对数期，然后通过荧光显微镜观察。驾驶员信息中心（DIC），差分干扰对比度。
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