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.2004年6月；24(11):4664-76.
doi:10.1128/MCB.24.14664-4676.2004。

RasGRP3的C-Src磷酸化介导的表皮生长因子受体对磷脂酶C-ε的Rap2B依赖性刺激

Matthias B采矿场 1, 弗兰克·冯·多普, 丹尼尔·萨特科夫斯基, 安贾·伯姆, 梅兰妮·凯珀, 简·诺尔特, Paschal A Oude Weernink教堂, 迪特尔·罗斯科普夫, 桑德琳·埃弗林, 卡尔·H·雅各布斯, 马丁娜·施密特
附属公司

RasGRP3的C-Src磷酸化介导的表皮生长因子受体对磷脂酶C-ε的Rap2B依赖性刺激

Matthias B采矿场等人。 分子细胞生物学. 2004年6月.

摘要

利用内源性表达PLC-偶联表皮生长因子（EGF）受体的HEK-293细胞，研究了在Ras-like和Rho GTPases控制下磷脂酶C-ε（PLC-epsilon）的受体酪氨酸激酶调节。通过EGF受体激活PLC-gamma1和PLC-epsilon的PLC和Ca（2+）信号，通过梭状芽孢杆菌毒素灭活Ras-related GTPases和显性阴性Rap2B的表达而被特异性抑制。EGF诱导Rap2B快速而持续的GTP负载，Rap2Bs与PLC-epsilon的结合，以及PLC-epsilon依赖于Rap2B-的易位到质膜。EGF对Rap2B的GTP负载受细胞内Ca（2+）螯合和脂肪酶活性PLC-gamma1表达的抑制，但不受PLC-epsilon表达的抑制。RasGRP3是一种Ca（2+）/二酰基甘油调节的鸟嘌呤核苷酸交换因子，用于Ras-like GTPases，但不表达其他各种交换因子，可通过EGF受体增强Rap2B的GTP负载和PLC/Ca（2+）信号。表皮生长因子诱导RasGRP3的酪氨酸磷酸化，而不是RasGRP1，明显是由c-Src引起的；抑制c-Src干扰EGF诱导的Rap2B激活和PLC刺激。总之，这些数据表明EGF受体通过PLC-gamma1激活和c-Src对RasGRP3的酪氨酸磷酸化触发Rap2B的激活，最终导致PLC-epsilon的刺激。

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数字

图1。
图1。
PLC-γ1和PLC-ɛ对EGF诱导的PLC和Ca的影响2+HEK-293细胞中的信号传导。将空载体（vector，V）、PLC-γ1、PLC-ɛ、PLC-β1、PLC-δ1（各为野生型）、脂肪酶非活性H335Q PLC-γl和H1144L PLC-ɥ或脂肪酶无活性H335 Q PLC-γ1与H1144L PLC-\603'的组合转染HEK-293细胞。转染100μg编码脂肪酶非活性PLC的DNA和25μg编码野生型PLC的DNA。转染后48小时，IP三在没有（基本）或存在100 ng EGF/ml（A）和EGF诱导的[Ca2+]我增加量（B）已确定。面板A中的数据表示平均值±SEM(n个=4至5）；在面板B中，[Ca的叠加轨迹2+]我如图所示。插图显示PLC的免疫印迹检测。
图2。
图2。
梭状芽孢杆菌毒素和类Ras-like GTPase突变体对EGF诱导的PLC和Ca的影响2+信号。（A） HEK-293细胞在不使用（对照）或使用100 pg毒素B/ml、300 pg毒素B-1470/ml或100 ng致死毒素/ml的情况下处理24 h，然后测定IP三在没有（基础）或存在100 ng EGF/ml（左面板）和EGF诱导的[Ca的情况下形成1分钟2+]我增加（右侧面板）。（B） 用空载体（对照）、S17N-Ras、S17N-Rap1A或S17N-Rap2B（各100μg DNA）转染HEK-293细胞。转染后48小时，IP水平三在没有（基础）或100 ng EGF/ml（左面板）和EGF-诱导的[Ca2+]我确定了增加（右侧面板）。（C） 用空载体（对照）、G12V-Rap1A、G12V Rap2A或G12V Rap2B（各25μg DNA）转染HEK-293细胞。转染后48小时，IP三在不使用（Basal）或使用100 ng EGF/ml的情况下测量1分钟的形成。插图：免疫印迹检测用空载体（V）或指示的GTPases转染的细胞裂解液中的GTPase。左侧面板中的数据表示平均值±SEM(n个=3至6）；在右侧面板中，[Ca的叠加轨迹2+]我如图所示。不重要。
图3。
图3。
Rap2B与PLC的相互作用-ɛ。（A） HEK-293细胞转染c-myc公司-标记的PLC-单独（对照）或与G12V Rap2B（25μg DNA）或与S17N Rap2B、S17N Ras或S17N Rap1A（各100μg DNA。48小时后，将细胞在不含（Basal）或含100ng/ml EGF的情况下处理5分钟，用抗c染色-myc公司抗体，并用免疫荧光激光共聚焦显微镜进行分析。棒材，5μm。（B） 用野生型Rap2B（50μg DNA）转染HEK-293细胞-myc公司-标记的野生型PLC-ɛ（WT）或H1144L PLC-ɦ（H1144L）（每个DNA 25μg）。48小时后，在不使用（−）或（+）100 ng EGF/ml的情况下，将细胞处理5分钟，然后用抗c-myc公司-抗体。c的免疫沉淀物（IP）-myc公司-标记的PLC-ɛ通过SDS-PAGE进行解析，并用抗-Rap2（α-Rap2）或抗-c探针进行探测-myc公司抗体（α-myc）如图所示。所示结果代表了三到四个实验。WB、Western blot。
图4。
图4。
类Ras GTPases的不同GEF对EGF诱导的PLC和Ca的影响2+信号。（A至C）用空载体（vector，V）、PDZ、C3G、Epac1、Repac、GRP2、RasGRP1或RasGRP3（每个25μg DNA）转染HEK-293细胞。转染后48小时，IP水平三在没有（基本）或存在100 ng EGF/ml（B）和EGF诱导的[Ca的情况下测量1分钟的形成2+]我增加量（C）已确定。（A） 转染细胞裂解液中HA标记GEF的免疫印迹检测。插入面板B：C3G的免疫印迹检测。（D） 用逆转录酶PCR（RT-PCR）检测HEK-293细胞中的RasGRP。面板B中的数据表示平均值±SEM(n个=3至5）；在面板C中，[Ca的叠加轨迹2+]我如图所示。
图5：。
图5：。
EGF受体激活Rap2B及其对RasGRP3、细胞内Ca的调节2+和PLC-γ1。（A） 用野生型Rap2B（50μg DNA）转染HEK-293细胞。在转染后48小时，在没有（−）或（+）100 ng EGF/ml的情况下刺激细胞指定的时间段。（B）HEK-293细胞仅转染Rap2B（对照）和指定的GEF（每个25μg DNA）。转染后48小时，在不使用（−）或使用（+）100ng EGF/ml的情况下刺激细胞5分钟。（C）用Rap2B转染HEK-293细胞。在转染后48小时，首先在无（对照）或100 nM Gö6976或20μM BAPTA/AM的情况下处理细胞30分钟，然后在无（Basal）或100 ng EGF/ml的情况下刺激细胞5分钟（左面板），或用1μM A23187或1μM离子霉素刺激细胞（右面板）。（D） HEK-293细胞单独转染Rap2B（对照）或H1144L PLC-ɛ或H335Q PLC-γ1（各100μg DNA）。转染后48小时，在不使用（Basal）或100 ng EGF/ml的情况下刺激细胞5分钟。用RalGDS-RBD提取GTP-负载的Rap2B，用SDS-PAGE分离，并用抗Rap2抗体进行免疫印迹。所示结果代表了三到六个实验。
图6。
图6。
EGF受体介导的c-Src对RasGRP3的酪氨酸磷酸化。（A） 用HA标记的RasGRP1或RasGRP3（各25μg DNA）转染HEK-293细胞。48小时后，在没有（−）或（+）10μM AG1478的情况下培养细胞30分钟，然后在没有（-）或（+100 ng EGF/ml的情况下刺激细胞5分钟，如图所示。WB、Western blot；α-HA，抗-HA。（B） 将RasGRP3（25μg DNA）单独转染HEK-293细胞，或将K298M c-Src或K457A Pyk2（每个DNA 75μg）转染HEK-293细胞。48小时后，将细胞在没有（−）或有（+）10μM PP2的情况下孵育30分钟，然后在没有（−）或有（+）100 ng EGF/ml的情况下刺激5分钟，如图所示。细胞裂解后，免疫沉淀HA标记的RasGRP，用SDS-PAGE分离，并用抗磷脂酰肌醇（α-PY）抗体进行检测。K298M c-Src和K457A Pyk2的表达通过特定抗体的免疫印迹实验得到确认（数据未显示）。（C） 纯化的GST标记的RasGRP3在无（−）或（+）重组C-Src的情况下，在[γ-32P] ATP或未标记的ATP。蛋白质通过SDS-PAGE分离，RasGRP3通过考马斯染色和放射自显影术检测(32P） 或用抗磷酸酪氨酸抗体（α-PY）进行免疫印迹。结果代表了三到五个实验。
图7。
图7。
钙的作用2+螯合和c-Src抑制EGF受体对Rap2B的激活和PLC的刺激。（A） 用野生型Rap2B（50μg DNA）单独转染HEK-293细胞（对照组），或用K457A Pyk2或K298M c-Src转染细胞（各转染75μg DNA。转染后48小时，在不使用（对照）或使用10μM AG1478或10μM PP2的情况下处理细胞30分钟，然后在不使用或使用100 ng EGF/ml或1μM A23187的情况下刺激细胞5分钟。用RalGDS-RBD提取负载GTP的Rap2B，用SDS-PAGE分离，并用抗Rap2抗体进行免疫印迹。显示的免疫印迹代表了四到六个实验。（B） 用空载体（对照）、K457A Pyk2或K298M c-Src（每个75μg DNA）转染HEK-293细胞。48小时后，首先在不使用（对照）或使用10μM PP2、20μM BAPTA/AM或PP2加BAPTA/AM（两者）的情况下处理细胞30分钟。IP（IP）三在没有（基础）或使用100 ng EGF/ml的情况下，在指定的时间段内测量形成。面板B中的数据代表平均值±SEM(n个=三到六）。
图8。
图8。
EGF受体介导的PLC-ɛ刺激模型。有关更多详细信息，请参阅正文。
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