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.2004年4月；24(7):2673-81.
doi:10.1128/MCB.24.7.2673-2681.2004。

抑制Mist1同源二聚体形成诱导胰腺腺泡-导管化生

朱丽琴 1, 泰语Tran, J迈克尔·卢克斯塔利斯, 孙培川, 芭芭拉·达姆斯, 斯蒂芬·科尼奇尼
附属公司

抑制Mist1同源二聚体的形成诱导胰腺腺泡至导管化生

朱丽琴等。 分子细胞生物学. 2004年4月.

摘要

胰腺由三个主要细胞系（内分泌、外分泌和导管）组成，这些细胞系由常见的原始前肠前体发育而来。负责内分泌细胞发育的转录网络已被广泛研究，但对维持外分泌和导管细胞谱系的转录因子知之甚少。一种对外分泌细胞功能很重要的转录因子是Mist1，它是一种在腺泡细胞中表达的基本螺旋-环-螺旋（bHLH）因子。为了对该蛋白进行分子表征，我们采用了共免疫沉淀和双分子荧光互补分析，以及电泳迁移率变化分析研究，以证明Mist1在体内以同二聚体复合物的形式存在。对表达显性负Mist1转基因（Mist1（突变碱性）[Mist1，MB）]的转基因小鼠的分析表明，抑制内源性Mist1的细胞自主效应。Mist1（MB）细胞变得杂乱无章，细胞间缝隙连接严重缺失，并表达高水平的糖蛋白簇合蛋白，这已被证明可以划分未成熟的腺泡细胞。Mist1转录活性的抑制也会导致导管特异性基因的激活，如细胞角蛋白19和细胞角蛋白20，这表明bHLH网络的改变会在成熟细胞中产生直接的腺泡-导管表型转换。我们认为Mist1是胰腺外分泌细胞的关键转录调节因子，在缺乏功能性Mist1的情况下，腺泡细胞无法维持其正常特性。

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数字

图1。
图1。
薄雾1MB（MB）和薄雾1MH公司蛋白质在DNA结合方面有缺陷。（A） Mist1内的点突变示意图MB（MB）和薄雾1MH公司蛋白质。mb，突变体基本结构域；Myc，C末端Myc表位标签（详见正文）；b、 基本域；mHLH，突变HLH。（B） EMSA使用32P-标记的E-盒寡核苷酸和来自对照细胞和表达所指示的Mist1蛋白的细胞的核提取物。在某些情况下，在超位移实验中使用了Mist1抗体（α-Mist1）或对照免疫前（P.I.）抗体。如预测，薄雾1MB（MB）和薄雾1MH公司不要绑定到E-box目标。游离DNA（F）、结合复合物（B）和Mist1超移复合物（箭头）的位置显示在凝胶的侧面。
图2。
图2。
Mist1在体内形成同二聚体复合物。（A） 细胞与编码Mist1、Mist1-Myc、Mist1的表达质粒共转染MB（MB）-Myc或Mist1MH公司-Myc蛋白（+）。转染后，分离核提取物并使用Myc抗体进行免疫沉淀（IP）。沉淀的蛋白质通过SDS-PAGE分离，转移到聚偏二氟乙烯膜上，然后使用Mist1抗体进行免疫印迹（IB）。尽管Mist1和Mist1MB（MB）与Mist1、Mist1共免疫沉淀MH公司不与野生型Mist1蛋白形成二聚体。共同免疫沉淀的Mist1蛋白的位置由箭头指示。注意，由于Myc表位标签的存在，Mist1-Myc蛋白的流动性低于野生型Mist1蛋白。（B） 双分子荧光互补证实了体内Mist1同二聚体的形成。单个Mist1表达质粒编码Mist1-YFP C末端（Mist1-Y）融合蛋白或Mist1-YFP N末端（Mist 1-YN）融合蛋白，分别或成对导入细胞。只有当Mist1-YN和Mist1-Y共存时，YFP荧光才被重建，这表明Mist1同源二聚体在这些细胞中具有功能性。注意，Mist1-YN和Mist1共存的细胞MH公司-YC不形成功能复合体。
图3。
图3。
（A） EMSA使用来自对照细胞和表达所示Mist1蛋白的细胞的核提取物。鉴于Mist1的表达MB（MB）有效阻止Mist1与DNA结合（Mist1+MB），Mist1MH公司对Mist1 DNA结合活性（Mist1+MH）没有影响。游离DNA（F）和结合复合物（B）的位置显示在凝胶的右侧。（B） 薄雾1MB（MB）是Mist1诱导的间隙连接蛋白32公共关系-吕克基因。胰腺AR42J细胞与间隙连接蛋白32公共关系-勒克报告基因和指示的Mist1表达质粒。Mist1蛋白的存在（+）或缺失（−）以及Mist1的量MB（MB）和Mist1MH公司（由三角形的厚度表示）显示在钢筋下方。薄雾1MH公司对没有影响间隙连接蛋白32公共关系-勒克表达式，而Mist1MB（MB）作为一种有效的抑制剂。
图4。
图4。
这个弹性蛋白酶公共关系-薄雾1MB（MB）-Myc公司表达质粒仅在胰腺外分泌腺泡细胞中表达。（A） 的示意图弹性蛋白酶公共关系-薄雾1MB（MB）-myc公司转基因。（B） 野生型（WT）和Mist1胰腺切片MB（MB）用Myc抗体检测转基因蛋白的表达，用Mist1抗体检测Mist1和Mist1，对（MB）小鼠进行免疫荧光分析MB（MB）蛋白质。几行老鼠表达Mist1MB（MB）虽然是腺泡细胞特异性的斑片状模式（详见正文）。（C） 使用针对Mist1（α-Mist1）的抗体检测内源性和转基因蛋白产物，或使用抗Myc（α-Myc）仅检测转基因Mist1产物，对指定小鼠系的蛋白提取物进行免疫印迹。薄雾1MB（MB）-由于Myc表位标签的存在，Myc蛋白的流动性（黑色箭头）低于野生型Mist1蛋白（红色箭头）。薄雾1MB（MB），喷雾1赫特和薄雾1MB（MB），喷雾1击倒对手指示Mist1基因型MB（MB）将小鼠杂交成杂合子薄雾1(薄雾1赫特)（表达的Mist1蛋白减少约50%）或薄雾1淘汰(薄雾1击倒对手)（表示没有Mist1）背景。
图5：。
图5：。
薄雾1MB（MB）-表达细胞不表达间隙连接蛋白Cx32。Mist1的胰腺切片MB（MB）对小鼠进行Cx32免疫荧光（绿色）和Mist1处理MB（MB）-Myc免疫荧光（红色）。薄雾1MB（MB）-表达细胞（由红色细胞核和箭头标识）不含可检测水平的Cx32缝隙连接蛋白（绿色斑点），而Mist1MB（MB）-阴性细胞（折线右侧的细胞）继续生成正常的缝隙连接斑块。面板A和E中的细胞核也用DNA荧光染色DAPI染色。
图6。
图6。
表达Mist1的胰腺腺泡细胞MB（MB）蛋白质呈现出紊乱的细胞结构。（A至D）Myc免疫组化结合苏木精和伊红染色（H&E）显示Mist1MB（MB）与非Mist1相比，腺泡细胞的结构严重紊乱MB（MB）-表达细胞。注意，非Mist1内质网的典型嗜碱性染色MB（MB）-表达细胞（箭头）在Mist1中完全缺失MB（MB）-表达细胞。面板B和C中的方框区域在面板D中以更高的放大倍数显示。在对照细胞中容易看到的成簇的酶原颗粒（箭头所示）在Mist1中没有组织MB（MB）-表达细胞。（E到H）透射电镜结合抗Myc免疫金标记证实Mist1MB（MB）-表达细胞（MB）高度紊乱，无酶原颗粒组织，酶原颗粒形态（箭头）中断，内质网大大减少且无组织（箭头）。所有薄雾1MB（MB）-表达细胞通过核定位抗Myc金颗粒的存在进行鉴定，这些金颗粒在野生型细胞（不表达Mist1MB（MB）).
图7。
图7。
在Mist1中Clusterin表达显著升高MB（MB）腺泡细胞。免疫荧光显示聚集蛋白染色（面板A和D中为绿色）、聚集蛋白和Myc染色（面板B和E中为红色细胞核）或聚集蛋白、Myc和DAPI染色（面板C和F中为蓝色细胞核）表明Mist1MB（MB）-表达细胞含有高水平的聚集蛋白。相比之下，非Mist1MB（MB）-表达细胞（Myc阴性）仍为聚集素阴性。面板A至C和D至F代表胰腺的两个不同区域。
图8。
图8。
薄雾1MB（MB）腺泡细胞表达导管细胞蛋白CK19和CK20。（A） 半定量逆转录-PCR分析CK20型野生型（WT）和Mist1中的表达MB（MB）（MB）胰腺组织。CK20型Mist1中的转录水平大大提高MB（MB）老鼠。车道−，无-RNA控制。（B） CK20和CK19表达的免疫印迹分析显示Mist1MB（MB）细胞中含有高水平的这些导管细胞蛋白。Akt蛋白水平可作为负荷控制。（C至J）在Mist1获得的切片上使用CK20（C至F）和CK19（G至J）抗体进行免疫荧光MB（MB）样品。薄雾1MB（MB）-表达腺泡细胞（箭头）表达高水平的CK20和CK19，而非Mist1MB（MB）-表达细胞（箭头）保持CK20和CK19阴性。（K至N）Mist1的腺泡细胞高倍放大MB（MB）小鼠显示单个腺泡细胞表达Mist1MB（MB）蛋白（Myc）共表达CK20。面板L、M和N中的箭头表示正常CK20-阳性夹层导管。
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参考文献

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