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.2004年3月1日；18(5):541-58.
doi:10.1101/gad.1151204。 Epub 2004年3月10日。

Unc51.1及其结合伙伴在中枢神经系统轴突生长中的作用

Toshifumi Tomoda先生 1, Jee Hae Kim先生, 财新展, 玛丽·E·哈顿
附属公司

Unc51.1及其结合伴侣在中枢神经系统轴突生长中的作用

Toshifumi Tomoda先生等。 基因开发. .

摘要

先前的研究表明，丝氨酸/苏氨酸激酶Unc51.1是神经元分化最早的基因之一，是颗粒细胞轴突形成所必需的。为了研究Unc51.1调节轴突延伸的机制，我们确定了两个直接结合伙伴。第一种是SynGAP，Ras的负调控因子，在发育中颗粒细胞的轴突和生长锥内表达。SynGAP的过度表达通过涉及Ras-like GTPase级联的机制阻止神经突起的生长。第二个结合伙伴是含有PDZ域的支架蛋白Syntenin，它结合Rab5 GTPase，其活性被SynGAP减弱。因此，我们的结果表明，含有Unc51.1的蛋白复合物通过Ras-like GTPase信号传导和Rab5介导的发育轴突内吞途径的调节控制轴突的形成。

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数字

图1。
图1。
Unc51.1绑定SynGAP。(A类)酵母双杂交分析总结。在β-半乳糖苷酶过滤试验中，测试了Unc51.1的C′端半（氨基酸653–1051）及其缺失突变体结合SynGAPα2 C′尾（氨基酸829–1328）的能力。根据代表菌落蓝色的深浅判断，相对结合强度表明：（+++）非常强；（++）强；（+）较弱；（–）未检测到绑定。(B)GST下拉分析。体外翻译SynGAP（氨基酸829–1328）的C′-尾部及其缺失突变体D1（氨基酸829-1053）和D2（1054-1328），用[35S] -蛋氨酸，并应用于由GST融合蛋白制成的色谱柱（仅GST、GST–Unc51.1 C′-tail[氨基酸653–1051]或GST–Unc51.2C′-t尾[氨基酸531–1037]）。从色谱柱中洗脱结合蛋白，并用SDS-PAGE进行分析，然后进行放射自显影。(C)确定结合Unc51.1的SynGAP的最小区域。在β-半乳糖苷酶试验中，检测SynGAP C′-末端的各种缺失突变体（D1–D5）结合Unc51.1 C′-端结构域（氨基酸653–1051）的能力。(D类)共沉淀分析。将全长SynGAP表达构建体转染到具有或不具有myc标记的全长Unc51.1构建体的HEK293T细胞中。用myc抗体免疫沉淀细胞提取物，用抗SynGAP抗体免疫印迹分析免疫复合物。(E类)用抗SynGAP抗体或正常兔IgG免疫沉淀从P6小脑提取的膜富集组分，用SDS-PAGE分析所得免疫复合物，然后用抗Unc51.1抗体和抗SynGA抗体免疫印迹。
图2。
图2。
Unc51.1和SynGAP在发育中小脑的表达。(A类)SynGAP蛋白在整个小脑发育过程中表达。通过免疫印迹分析从小脑不同发育阶段（E16、P1、P4、P6、P10、P20和成人）制备的蛋白质提取物。(B、 C类)Unc51.1的细胞分布(B)和SynGAP(C)P6小脑矢状切面（60μm）抗体染色显示。用TAG-1抗体标记深层外颗粒层（iEGL）分化颗粒细胞。（oEGL）包含增殖颗粒细胞的外生发层；（ML）分子层；（IGL）内部颗粒层。(D、 E类)SynGAP的亚细胞分布(D类)和Unc51.1(E类)在培养的颗粒神经元中。箭头表示Unc51.1和SynGAP的puntate双正。(F类)生长锥中的SyncGAP定位（箭头）。Tuj-1用于颗粒细胞轴突染色。酒吧：D类——F类，5微米。
图3。
图3。
Unc51.1和SynGAP的膜定位。(A类)从E16大脑皮层（ctx）和P6小脑（cb）制备的蛋白质提取物的粗膜部分（而非可溶性部分）中检测到Unc51.1和SynGAP。LDH仅在可溶性部分中鉴定，PSD-95和肌动蛋白在膜和可溶性部分中均被分离。(B)从P6小脑提取的蛋白质的逐步蔗糖梯度分离。每个分数（顶部分数，1，朝向底部分数，9）进行免疫印迹分析，显示抗体；图中绘制了每个蛋白质的“富集百分比”（=[每个组分的条带密度测定值/所有组分条带总密度测定值]×100）。(C)免疫电子显微照片显示Unc51.1在培养的颗粒细胞的延伸神经突内的囊泡定位。条形，300 nm。
图4。
图4。
SynGAP对小脑颗粒细胞轴突生长的抑制作用及其对Unc51.1的拯救作用。(A、 B类)从P6小脑纯化颗粒细胞，并感染仅表达GFP的逆转录病毒(A类)或SynGAP+GFP(B)GFP抗体染色可见轴突生长。棒材，50μm。(C)带有神经突的颗粒细胞定量。颗粒细胞被表达GFP的逆转录病毒感染（第1列），SynGAP+GFP（第2列），SynGAP+GFP–Unc51.1.wt（第3列），SyncGAP+GFP–Unc 51.1.KR（第4列），SynGAP+/ΔC′-域（第5列），LynGAP/ΔC'-尾+GFP，GFP–Unc51.1.KR（第9列）、SynGAP/Δ414-652+GFP（第10列）、GFP–H-Ras.wt（第11列）、GFP–H-Ras17（第12列）、SyncGAP+GFP–H Ras.wt（第13列）或SyncGAP+GFP–HRas17（第14列），以及含有轴突的细胞百分比（>20μm）进行评分。每个实验对100个细胞的轴突存在与否进行评分，并从至少三个单独的实验中计数：79.5%±6.2%（第1列）、30.8%±7.0%（第2列）、60.3%±4.5%（第3列）、25.0%±4.5%（第4列）、51.0%±2.7%（第5列）、28.4%±2.0%（第6列）、47.6%±6.1%（第7列）、81.5%±5.0%（第8列）表达所示蛋白的细胞中，30.3%±5.4%（第9列）、75.0%±3.2%（第10列）、77.3%±5.5%（第11列）、65.4%±3.4%（第12列）、68.3%±1.8%（第13列）或31.5%±4.8%（第14列）延伸轴突。统计上的显著差异(第页<0.001）。(D类)评估了所用逆转录病毒的蛋白表达水平。等效滴度（～5×106每种病毒的cfu）用于感染NIH3T3细胞（～1×106)在感染开始后48小时，收集细胞并使用myc和GFP抗体进行Western印迹。肌动蛋白抗体用于确保蛋白质负载量相等。使用的逆转录病毒为myc-SyncGAP+GFP（lane一)，myc-SynGAP+GFP–Unc51.1.wt（车道b条)，myc-SynGAP+GFP–Unc51.1.KR（车道c（c）)，GFP–Unc51.1.wt（车道d日)和GFP–Unc51.1.KR（车道e（电子）).
图5。
图5。
Unc51.1和SynGAP对报告分析中Ras-MAP激酶活性和培养中原代颗粒细胞中Ras-MAP激酶活性的影响。(A类)报告人分析方案。通过测量Ras-MAP激酶-Elk通路诱导的荧光素酶报告子活化，评估了在HEK293细胞中过表达SynGAP（有无Unc51.1）（野生型或激酶缺乏型，KR）的影响。(B)如图所示，用不同的构建物组合转染HEK293细胞，相对荧光素酶活性表示为相对光单位（RLU）与对照RLU水平的比值。用空载体（pcDNA3）对用于转染的DNA总量进行标准化。数据是来自三个独立实验的报告者活动的平均值±S.E。星号显示记者活动显著减少(第页< 0.001). (C)使用myc和Flag抗体通过Western blotting评估蛋白质的表达水平，以确认在分析中使用了等量的蛋白质。车道数（车道3–8)对应于中的列号B.
图6。
图6。
SynGAP作为Rab5 GAP发挥作用。(A类)SynGAP的GAP结构域在体外刺激Rab5 GTPase活性。存在或不存在SynGAP的GAP结构域时GST-Rab5融合蛋白GTPase活性的时间进程。将GST-Rab5与对照GST蛋白（钻石）孵育，对GST-Rap5的缓慢内源性GTPase活性影响最小。相反，添加GST–SynGAP/GAP融合蛋白加速了GST–Rab5（方块）的GTPase活性。星号显示束缚[γ-32P] -每个时间点的GTP(第页< 0.01). (B)用SynGAP+GFP或GFP单独瞬时转染HEK293T细胞，并检测其摄取[德克萨斯红]结合转铁蛋白的能力。通过GFP表观荧光鉴定转染细胞。尽管大多数对照细胞显示出转铁蛋白摄取，但SynGAP过表达后显示摄取的细胞较少。棒材，50μm。(C)SynGAP或SynGAP+Rab5/Ras过度表达后摄取转铁蛋白的细胞定量。从三个独立的实验中对含有或不含转铁蛋白的GFP阳性细胞进行评分和计数。数据为转铁蛋白阳性细胞（封闭柱）或转铁蛋白阴性细胞（开放柱）百分比的平均值±S.E；当转染载体+GFP、SynGAP+GFP，SynGAP+Rab5.wt+GFP或SynGAP+Ras.wt+GFP质粒时，转铁蛋白阳性细胞分别为88.2%±3.6%、31.5%±4.1%、68.0%±8.0%或61.3%±4.9%。星号显示转铁蛋白摄取显著增加(第页<0.01）与SynGAP诱导的摄取下调相比。(D类)感染表达SynGAP和GFP–Rab5的逆转录病毒的小脑颗粒细胞恢复轴突延伸。(E类)感染表达SynGAP和GFP的逆转录病毒的小脑颗粒细胞表现出截短的形态。通过抗GFP抗体染色检测感染细胞和形态。棒材，10μm。(F类)含神经突颗粒细胞的定量。颗粒细胞感染了仅表达GFP的逆转录病毒（第1列）、SynGAP+GFP（第2列）、SynGAP+GFP–Rab5.wt（第3列）、SyncGAP+GFP-Rab5.S34N（第4列）、Unc51.1.KR+GFP（第一列）、Unc51.1.KR+GFP–Rab 5.wt，并对含有突起（>20μm）的细胞百分比进行评分。每个实验中有100个细胞被计分为是否有突起，并从至少三个单独的实验中进行计数。第1列和第2列的数据来自图4C：79.5%±6.2%（第1列）、30.8%±7.0%（第2列）、72.0%±3.2%（第3列）、32.3%±3.0%（第4列）、25.8%±4.5%（第5列）、66.2%±3.2%、33.1%±1.6%（第7列）、82.0%±6.1%（第8列）或69.4%±8.3%（第9列）表达所示蛋白的细胞延伸轴突。统计上的显著差异(第页<0.001）。
图7。
图7。
培养颗粒神经元中Unc51.1.KR或SynGAP表达导致的囊泡膜结构紊乱。(顶部)尽管仅表达VAMP2–GFP融合蛋白的对照细胞沿着轴突显示出规则排列的VAMP-阳性小泡(A类)，细胞过度表达SynGAP+VAMP2–GFP(B)或Unc51.1.KR+VAMP2–GFP(C)有不规则定位的小泡。棒材，10μm。(中部)对显示的神经元进行了线性扫描在上面使用Metamorph分析软件（Universal Imaging Corporation）绘制轴突全长的平均灰度。图中的峰值对应于每个VAMP2–GFP阳性点。(底部)在每次感染实验中，每个点子的像素计数超过~100个点子（VAMP2–GFP，左边; SynGAP+VAMP2–GFP，中心; Unc51.KR+VAMP2–绿色荧光蛋白，正确的)通过使用Metamorph软件，并根据其像素大小对每个泪点进行分类。这个X（X）-轴显示像素大小的范围Y（Y）-axis是在X（X）-轴。
图8。
图8。
Syntenin结合Unc51.1和Rab5。(A类)Unc51.1（氨基酸829–1051）的C′-尾结构域和删除最后三个氨基酸（VYA——; 氨基酸829–1048）在β-半乳糖苷酶过滤分析中测试其结合全长Syntenin及其缺失突变体（跨越SynteninN′-末端一半的N和跨越Syntening两个PDZ结构域的2PDZ）的能力。Unc51.1 C′-tail对Syntenin全长结构域和两个PDZ结构域表现出很强的结合（+++）。(B)将COS7细胞与HA标记的全长Syntenin和myc标记的全长Unc51.1或VYA缺失的Unc51-1共转染。用抗HA抗体进行免疫沉淀，用SDS-PAGE分析免疫复合物，然后用抗myc抗体进行免疫印迹。HA印迹表明免疫复合物中存在Syntenin。(C)用myc-Unc51.1和HA-Syntenin构建物共同转染COS7细胞，固定并用单克隆myc（绿色）和多克隆HA抗体（红色）双重染色。棒材，10μm。(D类)在β-半乳糖苷酶过滤试验中测试全长Rab5结合全长Syntenin和缺失突变体（N和2PDZs）的能力。Rab5对Syntenin的全长和两个PDZ结构域表现出非常强的结合（+++）。(E类)将myc标记的全长Unc51.1和带有或不带有HA标记的Syntenin的myc标记Rab5转染COS7细胞。用抗Rab5抗体进行免疫沉淀，用SDS-PAGE分析免疫复合物，然后用抗myc和抗HA抗体进行免疫印迹。将COS7细胞与HA标记的全长Syntenin和myc标记的全长Unc51.1或VYA缺失的Unc51-1共转染。用抗HA抗体进行免疫沉淀，用SDS-PAGE分析免疫复合物，然后用抗myc抗体进行免疫印迹。HA印迹表明免疫复合物中以转染依赖的方式存在Syntenin。(F类)用抗Rab5抗体或正常兔IgG免疫沉淀从P6小脑提取的膜富集组分，用SDS-PAGE分析产生的免疫复合物，然后用抗Rab2抗体和抗Unc51.1抗体进行免疫印迹。
图9。
图9。
Unc51.1及其结合伙伴在轴突形成中发挥作用的拟议机制的图示。Unc51.1下调SynGAP的GAP活性，使Ras/Rab5 GTPases部分通过内吞途径在轴突形成中发挥作用。
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