Phosphorylation of BCL-2 regulates ER Ca2+ homeostasis and apoptosis

doi:10.1038/sj.emboj.7600104

.2004年3月10日；23(5):1207-16.

doi:10.1038/sj.emboj.7600104。 Epub 2004年3月4日。

BCL-2磷酸化调节ER-Ca2+稳态和凋亡

迈克尔·C·巴斯克¹, 卢卡·斯科拉诺, 斯科特·奥克斯, Tullio披萨, 斯坦利·科尔斯迈尔

附属公司

PMID： 15010700
预防性维修识别码：项目经理380968
内政部： 10.1038/sj.emboj.7600104

BCL-2磷酸化调节ER-Ca2+稳态和凋亡

迈克尔·C·巴斯克等。欧洲工商管理硕士J. 2004.

.2004年3月10日；23(5):1207-16.

doi:10.1038/sj.emboj.7600104。 Epub 2004年3月4日。

作者

迈克尔·C·巴斯克¹, 卢卡·斯科拉诺, 斯科特·奥克斯, Tullio披萨, 斯坦利·科尔斯迈尔

附属

¹美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院百翰女子医院达纳法伯癌症研究所霍华德·休斯医学院病理与医学系，邮编02115。

PMID： 15010700
预防性维修识别码：项目经理380968
内政部： 10.1038/sj.emboj.7600104

摘要

非结构环内BCL-2的磷酸化抑制其抗凋亡作用。我们发现磷酸化的BCL-2主要定位于内质网（ER），并测试磷酸化是否会控制其在该细胞器的活性，其中Ca（2+）动力学是细胞凋亡的关键控制点。磷酸化大大抑制BCL-2降低[Ca（2+）]（er）的能力，并保护其免受Ca（2+）依赖性死亡刺激。与表达BCL-2的细胞相比，表达非磷酸化BCL-2（AAA）的细胞从内质网中漏出的Ca（2+）增加，稳态[Ca（2+）]（ER）储存量进一步减少。因此，当BCL-2被磷酸化时，内质网的Ca（2+）释放增加，线粒体Ca（2+）吸收继而增加。我们还证明，BCL-2的磷酸化抑制其与促凋亡家族成员的结合。这种抑制机制表现在内质网，磷酸化的BCL-2不能结合促凋亡的成员。[Ca（2+）]（er）被证明与BCL-2结合促凋亡BH3-only成员的能力相协调，进一步整合了凋亡途径和Ca（2+）调节。出乎意料的是，ER-Ca（2+）动力学的调节是BCL-2磷酸化改变细胞凋亡敏感性的主要途径。

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数字

图1
BCL-2型^{美国汽车协会}-表达细胞比BCL-2更具抗性^重量-表达细胞对钙依赖性死亡刺激。(A类)表达新载体BCL-2的Jurkat细胞^重量或BCL-2^{美国汽车协会}按指示处理，用annexin V染色，并用FACS分析。(B类)MEF或(C类)Jurkat品系在含有30μM花生四烯酸的无血清培养基中处理指定时间。(天)Jurkat细胞在含有指示浓度h的生长培养基中处理17 h₂O（运行）₂. (E类)按照材料和方法中的描述对未经处理的Jurkat（左面板）或MEF（右面板）细胞进行分馏，然后进行SDS–PAGE并用所示抗体进行Western blot。

图2
BCL-2型^重量降低可释放的ER Ca水平²⁺和非磷酸化BCL-2^{美国汽车协会}突变体进一步降低水平。(A类)稳定转染各种BCL-2构建物的MEF细胞系负载细胞溶质钙指示剂Fura-2，并在没有细胞外钙的情况下用200 nM的thapsigargin（TG）进行脉冲处理。达到基线后，将钙添加回最终浓度2 mM游离[Ca²⁺]. (B类)对于（A）中所示的曲线，在TG诱导的内质网储存物释放后测量细胞内钙的基础和峰值水平（10次实验的平均值）。

图3
BCL-2中的线粒体^{美国汽车协会}-表达细胞在从内质网释放后吸收较低水平的钙(A类)用200 nM thapsigargin处理装载有Rhod-2的MEF株，并拍摄序列图像。选择基线和峰值荧光图像进行比较。完整的图像序列在补充数据电影1-3中给出。(B类)对于（A）中的图像，选择线粒体区域，并随时间测量归一化荧光强度值（参见材料和方法）。(C类)装载有Rhod-2的MEF用0.001%洋地黄素渗透，并暴露于14.5μM Ca²⁺钌红（100μM）是线粒体钙单转运蛋白的抑制剂，添加在指定位置。

图4
表达BCL-2的细胞^{美国汽车协会}内质网钙峰值水平较低，内质网的钙泄漏率较高(A类)按照材料和方法中的描述，对转染ER-靶向绿原蛋白的细胞进行去钙处理。在监测绿宝石发光的同时，重新添加钙以获得ER中的峰值钙含量(B类)在钙峰值时，用tBuBHQ抑制SERCA介导的ER钙摄取，并测定渗漏率。

图5
BCL-2必须与促凋亡蛋白结合以降低内质网钙，这种结合被磷酸化阻止。(A类)分析Jurkat细胞系的RIPA提取物的钙处理蛋白水平。(B类)GST-BCL-2用JNK激酶处理，在SDS-PAGE上运行，并用抗S70P抗体进行银染或免疫印迹。(C类)然后将该蛋白与纯化的BAX或BID蛋白混合在NP-40缓冲液中，用GSH珠捕获，并通过Western blot评估与BAX或BID的关联，并通过密度计进行定量。(天)用蚜虫灵或诺卡唑处理Jurkat细胞16 h，然后在IP缓冲液中制备全细胞提取物，用指示的抗体免疫沉淀，然后用Western blot检测。(E类)亚细胞分离后，将MEF系的轻膜组分溶解在NP-40或CHAPS IP缓冲液中，用抗BCL-2抗体进行免疫沉淀，并通过Western blot检测相关BIM。(F类)表达所示结构的Fl 5.12细胞系被加载Fura-2，并测量治疗后的钙峰值。

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