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.2004年1月14日；23(1):169-79.
doi:10.1038/sj.emboj.7600030。 Epub 2004年1月8日。

翻译起始因子2的预先条件磷酸化对细胞的保护作用

菲比·D·路 1, 塞琳·朱塞, 斯特凡·马西尼亚克, 张玉红, 伊莎贝尔·诺沃亚, Donalyn Scheuner先生, Randal J Kaufman公司, 大卫·罗恩, 希瑟·P·哈丁
附属公司

翻译起始因子2的预先条件磷酸化对细胞的保护作用

菲比·D·路等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

翻译起始因子2α亚单位（eIF2alpha）的瞬时磷酸化抑制翻译，并在各种应激条件下激活选择性基因表达。eIF2α磷酸化依赖性综合应激反应中的缺陷削弱了对内质网中错误蛋白质积累（ER应激）、氧化应激和营养剥夺的抵抗力。为了研究eIF2α磷酸化在分离平行应激信号通路中的假设保护作用，我们将内质网激酶（PERK）的激酶结构域融合到一个结合小二聚体分子的蛋白质模块，PERK是一种内质网应激诱导的eIF2 alpha激酶，通常通过二聚体激活。这种人工eIF2α激酶Fv2E-PERK的活性从属于二聚体，并与上游应激信号分离。Fv2E-PERK激活增强了许多应激诱导基因的表达，并保护细胞免受氧化剂、过氧亚硝酸盐供体和内质网应激的致命影响。我们的研究结果表明，eIF2α磷酸化可以独立于其他平行应激诱导信号启动细胞保护基因表达途径中的信号传导，并且该途径的激活可以单独促进应激耐受预处理状态。

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图1
图1
促进eIF2α磷酸化的应激保护HT22细胞免受谷氨酸诱导的细胞死亡。（A）用thapsigargin或tunicamycin预处理HT22细胞1 h后，恢复5 h，然后用5 mM谷氨酸（封闭方格）或10 mM谷氨酸钠（开放方格）挑战24 h后，细胞存活。存活率表示为每一预处理组中经谷氨酸处理的细胞减少的MTT百分比，与经相同预处理但未接触谷氨酸的细胞减少MTT的百分比相比。所示数值为代表性实验的平均值和SEM，该实验一式三份，重复两次。（B）用磷酸化eIF2α（eIF2 a-P）特异性抗血清孵育的细胞质提取物、总eIF2 a和GADD34的免疫印迹，以及用未经处理的HT22细胞或用thapsigargin（Tg，0.5μM）或tunicamycin（Tm，0.3μg/ml）处理0.5或1 h以及恢复5 h后的ATF4和CHOP抗血清孵育的核提取物的免疫印记（R）。
图2
图2
eIF2α磷酸化受损使HT22细胞对谷氨酸氧化毒性敏感。(A类)来自ψ的磷酸化eIF2α（eIF2α-P）和总eIF2α的免疫印迹空的、GADD34或GADD34ΔC用400 nM thapsigargin（Tg）处理指定时间的细胞。(B)用表达eIF2α磷酸酶活性形式（GADD34）的逆转录病毒转导的结晶-维生素染色HT22细胞的显微照片，该酶是一种非活性突变体ΔC)或空向量（ψ空的). 转导后，细胞以克隆密度被镀，并在染色前在常规培养基或补充还原化合物βME的培养基中培养6天。(C类)用于稳定表达GADD34，ψ的晶体-聚乙二醇染色HT22细胞的显微照片空的或GADD34ΔC并在含有βME的培养基或培养基中以常规克隆密度进行培养(D类)HT22 GADD34，ψ的存续空的或GADD34ΔC细胞在缺乏βME的培养基中暴露于谷氨酸24小时后。100%存活率定义为未暴露于谷氨酸钠的每个细胞系的MTT降低。图中所示为一个典型的重复实验，重复两次。
图3
图3
通过内质网应激将PERK的eIF2α激酶活性与其激活脱钩。(A类)Fv2E-PERK融合蛋白的示意图。指出了修饰的FKBP结构域（Fv）和PERK的跨膜结构域（TM）。(B)用1nM AP20187二聚体或thapsigargin（Tg）处理表达Fv2E-PERK的HT22细胞和亲代HT22细胞的裂解物中磷酸化的Fv2E-PERK（eIF2α-P）和总eIF2β，以及下游靶点GADD34和CHOP的免疫印迹。活化和磷酸化（Fv2E-PERK）的位置P（P）)和非活性的次磷酸化Fv2E-PERK（Fv2E-PERK0)显示。(C类)的自动放射自显影35S-蛋氨酸并入表达Fv2E-PERK的HT22细胞中新合成的蛋白质中，这些细胞未经处理（UT）或用1 nM AP20187处理1 h或400 nM thapsigargin（Tg）处理0.5 h(D类)用2 nM的AP20187二聚体处理后，在野生型（S/S）和突变型（A/A）eIF2α基因型表达Fv2E-PERK的MEF的裂解液中，对Fv2E-PERK、磷酸化（eIF2 A-P）和总eIF2-α以及下游靶点GADD34和ATF4进行免疫印迹。(E类)具有野生型（S/S）和突变型（A/A）eIF2α基因型的Fv2E PERK MEFs中ISR靶基因表达水平的微阵列分析。显示了375个基因在AP20187处理的Fv2E-PERK MEF（4或8小时）和突尼斯霉素处理的野生型MEF或仅在突尼斯霉素治疗的MEF中诱导至少两倍。基因的表达水平以阴影表示，白色表示低表达水平，黑色表示高表达水平。对这些基因进行聚类，以揭示一组PERK依赖性衣霉素诱导的基因，这些基因也被Fv2E-PERK激活（a组），以及一组PER依赖性衣霉菌素诱导的不被Fv2-PERK活化诱导的基因（B组）。
图4
图4
激活Fv2E-PERK可提高谷氨酸暴露的HT22细胞的存活率。(A类)在未经处理的细胞（UT）中以及暴露于1或2 nM AP20187 15分钟后的不同恢复点对Fv2E-PERK、磷酸化eIF2α（eIF2 a-P）、总eIF2β和下游靶GADD34进行免疫印迹。激活的Fv2E PERK的位置P（P）和非活动Fv2E-PERK0指示蛋白质。(B)35通过用1 nM AP20187（圆形）或2 nM AP2018（方形）处理15分钟，在从翻译抑制中恢复的不同时间点，S-蛋氨酸并入新合成的蛋白质中。翻译用百分比表示35S-甲硫氨酸掺入未经处理的细胞，其任意设定为100%。(C类)亲代HT22细胞或表达Fv2E-PERK的细胞经1 nM处理后的存活率，或2 nM AP20187或乙醇载体15分钟，然后恢复5或12小时，随后暴露于指示浓度的谷氨酸24小时。100%存活率定义为每个AP20187治疗组中未暴露于谷氨酸的细胞中的MTT减少。显示了重复进行和重复四次的代表性实验的平均值±SEM。(D类)结晶-维生素染色的亲代HT22细胞或表达Fv2E-PERK的细胞的显微照片，用1或2 nM AP20187或乙醇载体处理1小时，然后恢复5小时，随后暴露于谷氨酸24小时。细胞被切换到常规培养基中6天，然后用结晶紫染色。
图5
图5
AP20187介导的Fv2E-PERK激活可降低谷胱甘肽诱导的内源性过氧化物水平，并挽救谷胱甘苷诱导的谷胱甘酮耗竭。二氯荧光素荧光的双通道FAC扫描(X（X）-轴）和碘化丙啶荧光(Y（Y）-轴）亲代HT22细胞(A类–D类)或Fv2E-PERK单元(E类–H（H）)要么是模拟预处理(A类,C类,E类,G公司)或用1 nM AP20187预处理1 h，然后再恢复5 h(B,D类,F类,H（H）)在暴露于5 mM谷氨酸10小时之前(C类,D类,G公司,H（H）)如图所示。二维FAC扫描的每个象限中的细胞分数显示在下表中。[表：见正文]（一）表达Fv2E-PERK的HT22细胞中的谷胱甘肽水平，可以是模拟预处理的，也可以是用1 nM AP20187预处理后5小时的恢复期。在暴露于5mM谷氨酸后的不同时间点或在不存在谷氨酸的情况下在恢复后10小时测量谷胱甘肽水平。平均值±SEM(n个=2）。
图6
图6
AP20187在MEF中诱导的Fv2E-PERK活化对内质网应激和亚硝化应激具有保护作用。(A类)野生型Fv2E-PERK的免疫印迹(珀克+/+)和Perk−/−选择用于稳定表达Fv2E-PERK的细胞，并用1 nM AP20187处理指定的时间段。活化和磷酸化（Fv2E-PERK）的位置P（P）)和非活性的次磷酸化Fv2E-PERK（Fv2E-PERK0)显示。(B)免疫沉淀内源性PERK、磷酸化eIF2α（eIF2 a-P）、eIF2总α、ATF4和CHOP的免疫印迹分析珀克+/+和Perk−/−表达Fv2E-PERK并用1 nM AP20187或400 nM thapsigargin（Tg）处理的细胞。活化和磷酸化（内源性PERK）的位置P（P）)和非活性的低磷酸化PERK（内源性PERK0)显示。(C类)如方法所述，暴露于衣霉素（Tm）16 h前，用AP20187或乙醇载体处理表达Fv2E-PERK的野生型（S/S）或突变型（A/A）eIF2α基因型的结晶-葡萄球菌染色细胞的显微照片。暴露于衣霉素后更换培养基，6天后细胞被结晶紫染色。(D类)表达Fv2E-PERK的野生型（S/S）或突变型（A/A）eIF2α基因型细胞的存活率，该基因型用1 nM AP20187或乙醇载体预处理，并暴露于指定浓度的SIN-1。100%存活率定义为未接触SIN-1的细胞的MTT减少。显示了一式三份和重复两次的代表性实验的平均值±SEM。
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