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.2004年1月；24(1):144-53.
doi:10.1128/MCB.24.144-153.2004。

即时早期基因产物网络传播丝裂原活化蛋白激酶信号振幅和持续时间的细微差异

利昂·O·墨菲 1, 杰弗里·麦凯根（Jeffrey P MacKeigan）, 约翰·布莱尼斯
附属公司

即时早期基因产物网络传播丝裂原活化蛋白激酶信号振幅和持续时间的细微差异

利昂·O·墨菲等。 摩尔细胞生物学. 2004年1月.

摘要

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号的强度和持续时间已被证明调节不同细胞类型的细胞命运。在本研究中，描述了一种一般机制，解释了信号动力学中的细微差异如何转化为特定的生物结果。在成纤维细胞中，即时早期基因（IEG）编码的Fos、Jun、Myc和早期生长反应基因1（Egr-1）转录因子的表达通过持续的细胞外信号调节激酶1和2（ERK1和-2）信号传导显著延长。其中一些蛋白质包含ERK、FXFP（DEF）结构域的功能性对接位点，用于局部浓缩活性激酶，因此表明它们可以作为ERK传感器发挥作用。持续的ERK信号调节这些IEG编码传感器的翻译后修饰，这有助于它们在G（1）-S转换期间的持续表达。含DEF域的传感器还可以解释ERK信号强度的微小变化，这些变化是由激动剂浓度减少不到三倍引起的。因此，下游靶基因表达和细胞周期进程发生了显著变化。

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数字

图1。
图1。
Fra蛋白的DEF结构域依赖性调节。（A） c-Fos、Fra-1和Fra-2 COOH末端的对齐显示氨基酸身份（黑体字母）、ERK和RSK启动磷酸化位点（下划线）和DEF域（方框）。这些序列来自大鼠（c-Fos）和小鼠（Fra-1和Fra-2）蛋白质，数字表示氨基酸位置。（B） 用指示的Fos等位基因转染NIH 3T3细胞，去除血清，用EGF（50 ng/ml）处理5分钟。如有指示，在用EGF处理5分钟之前，用UO126（5μM）预处理细胞30分钟。然后用抗c-Fos、抗磷酸-Thr325 c-Fos和，和抗ERK抗体。（C和D）NIH 3T3细胞转染了指示的DEF域突变体Fra-2和Fra-1等位基因，并按照B组所述进行处理。使用抗Fra-2、抗Fra-1和抗ERK抗体进行免疫印迹。
图2。
图2。
DEF结构域介导的c-Myc磷酸化调控。（A） 图示详细说明了假定的DEF域（FPYP），NH2-末端磷酸化位点Thr58和Ser62、Myc-box II（MbII）、碱性DNA结合结构域（B）和螺旋-环-螺旋（HLH）-亮氨酸拉链（zip）结构域。（B） 用c-Myc或对照载体转染NIH 3T3细胞，并按照图1B图例所述进行处理。c-Myc从细胞裂解物中免疫沉淀（IP），并用抗c-Myc或抗磷酸特异性Ser62（pS62）抗体分析每个样本。用抗磷酸-ERK1/2抗体测定细胞裂解液中ERK激活的Western blot分析。IgG、免疫球蛋白G（C）表达所示C-Myc蛋白的静止细胞用EGF处理5分钟并裂解，然后进行C-Myc免疫沉淀。免疫沉淀物的Western blot分析使用抗c-Myc或抗磷酸化-Ser62抗体，细胞裂解物的分析使用抗c-Myc或ERK抗体。所示数据代表了三个实验。
图3。
图3。
IEG的全球诱导。（A） 用EGF（25 ng/ml）或PDGF-BB（20 ng/ml。Western blotting用于可视化Fos家族蛋白和c-Jun的表达，以及ERK激活动力学（下表）。（B） 按照A组所述处理细胞，用抗Egr-1、抗JunB或抗ERK抗体分析裂解产物。（C） 首先从提取物中免疫沉淀C-Myc，然后进行Western分析，以分析C-Myc的诱导作用。用抗磷酸化ERK1/2（αpERK）抗体分析ERK的激活。所有显示的数据都代表了至少四个实验。
图4。
图4。
IEG产品的持续表达需要ERK途径。用PDGF诱导瑞士3T3细胞90分钟，然后用UO126（5μM）或DMSO（0.1%）再处理120分钟。（B） 在最初用PDGF处理细胞90分钟（通道2至10）或120分钟（通道11至13）后，向细胞中添加DMSO或UO126。c-Myc从细胞裂解物中免疫沉淀并进行Western分析。（C） 用PDGF诱导瑞士3T3细胞5小时，然后在细胞裂解前用UO126处理20或30分钟。对照细胞（−）用二甲基亚砜处理30分钟。αpERK，抗磷酸-ERK。（D）用PDGF诱导的细胞在UO126存在和不存在（DMSO）的情况下再培养5小时。在指定的时间制备细胞提取物，并进行Western分析以检测Fra-1的水平和ERK的激活动力学。所示数据代表了三个实验。
图5：。
图5：。
ERK信号强度和持续时间的增加减少对IEG产物磷酸化和持续表达有很大影响。（A） 将静止的瑞士3T3细胞用不同量的PDGF处理指定的时间并进行裂解。通过Western blotting测定内源性c-Fos和Egr-1水平以及ERK激活动力学。通过Western blotting检测c-Fos中Thr325的磷酸化和c-Fos的总水平。（C） ERK1从PDGF处理的细胞中免疫沉淀，其激酶活性通过免疫复合物激酶分析进行定量。所示数据为三个独立实验的平均值±标准误差。（D和E）细胞按照A组所述进行处理，并通过Western分析分析Fra-2和Fra-1的水平。这些数据代表了三到四个实验。
图6。
图6。
ERK信号强度影响AP-1靶基因表达和S期进入。（A） 用PDGF（10或4 ng/ml）处理静止的瑞士3T3细胞，并用抗细胞周期素D抗体测量细胞提取物中的细胞周期素D1水平。（B） 用PDGF处理玻璃盖玻片上培养的静态瑞士3T3细胞，并按照材料和方法中的描述分析BrdU掺入。所显示的数据代表了三个独立的实验。DAPI，4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚。（C） PDGF诱导静止瑞士3T3细胞11.75 h，BrdU（20μM）处理15 min，然后固定。按照材料和方法中的描述，通过FACS分析对每个治疗组中BrdU阳性细胞的数量进行量化。所示数据为三次测定的平均值±标准误差，代表三个独立实验。
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