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.2004年2月；15(2):543-51.
doi:10.1091/mbc.e03-07-0487。 Epub 2003年11月14日。

热休克对人类基因组组成异色域转录激活的影响

尼科莱塔·里兹 1, 马可·德内格里, 伊利亚·恰迪, 玛格丽塔·科里奥尼, Valgardsdottir路, 法比奥·科比安奇, 西尔瓦诺·里瓦, 朱塞佩·比亚蒙蒂
附属公司

人类基因组组成型异色结构域对热休克反应的转录激活

尼科莱塔·里兹等。 分子生物学细胞. 2004年2月.

摘要

热休克触发核应激体的组装，其中包含热休克因子1和RNA加工因子的子集。这些结构形成于特定人类染色体的着丝粒周围异色区，其中9号染色体。在这篇文章中，我们表明这些异色域具有典型的常染色区域的表观遗传状态。与基因组转录活性部分类似，应激体实际上富含乙酰化组蛋白H4。乙酰化在热休克恢复6小时时达到峰值。此外，异染色质标记物，如赖氨酸9上甲基化的HP1和组蛋白H3，被排除在这些核区之外。此外，热休克触发了RNA分子的短暂积累，其大小不均匀，包含9号染色体着丝粒周围异染色质中发现的卫星III序列亚类。这是第一份关于基因组组成异色部分在应激刺激下转录激活的报告。

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图1。
图1。
TSA抑制应力体的组装。用增加TSA浓度的方法处理HeLa细胞6小时。去除药物后，细胞在42°C下热休克1h，然后在37°C下恢复1h，最后用4%甲醛固定。然后分别用（1）兔抗hnRNP HAP多克隆抗体、（2）抗SF2/ASF单克隆抗体-96或（3）鼠抗HSF1单克隆抗体10H8对细胞进行染色。用FITC-偶联的抗兔、抗鼠或抗大鼠-山羊抗体检测出一级抗体。在三个独立的实验中测量了带有应力体的细胞比例，每个实验计数500个细胞。该分数表示为仅用TSA（乙醇）溶剂处理的细胞中测量值的百分比。白色条，hnRNP HAP；灰色条，SF2/ASF；黑条，HSF1。
图2。
图2。
应激体含有乙酰化组蛋白H4。HeLa细胞在42°C下热休克1h，然后在37°C下恢复1h。然后将细胞固定在4%甲醛中，并与兔抗高乙酰化组蛋白H4的多克隆抗体以及抗HAP 16C3单克隆抗体或大鼠抗HSF1 10H8单克隆抗体共染色。还测定了hnRNP HAP和Ac-H4在非应激细胞中的分布（37°C）。用FITC-结合的抗兔抗体和罗丹明结合的抗鼠或抗鼠山羊抗体检测出一级抗体。然后用共焦激光显微镜分析细胞。显示相同单元格的图像。
图3。
图3。
与应激体相关的组蛋白H4乙酰化模式。如图所示，用针对组蛋白H4不同乙酰化赖氨酸残基的兔多克隆抗体对未应激（37°C）或热休克HeLa细胞（42°C下1小时，37°C下恢复1小时）（42°C）进行染色。用FITC-偶联的抗兔山羊抗体检测出一级抗体。为了揭示应激体的定位，热休克细胞与抗HAP单克隆抗体16C3和罗丹明结合的抗鼠-山羊抗体共染色。显示了典型细胞的共焦激光显微镜图像。
图4。
图4。
应力体不是HP1β积聚的主要场所。将未受力（37°C）或在42°C下热冲击1小时，然后在37°C（42°C）下1小时的HeLa细胞固定在4%甲醛中。细胞与兔抗hnRNP HAP多克隆抗体共染色，以显示应激体，并与大鼠HP1β特异性单克隆抗体MAC353共染色。用FITC-偶联抗兔抗体和罗丹明偶联抗大鼠山羊抗体检测出一级抗体。显示了相同场的共焦激光显微镜图像。
图5。
图5。
应激体不是K9上甲基化的组蛋白H3（H3-mK9）积累的主要位点。HeLa细胞在42°C（42°C）下无应力（37°C）热休克1小时或允许恢复指定的时间间隔，固定在4%甲醛中。用抗HAP单克隆抗体16C3和抗分支α-甲基H3-K9肽的兔抗体对细胞进行染色。用FITC-偶联抗鼠抗体和罗丹明偶联抗兔山羊抗体检测出一级抗体。显示了相同场的共焦激光显微镜图像。
图6。
图6。
应激体中组蛋白H4乙酰化动力学。将HeLa细胞在42°C下热休克15、30或60分钟。热休克1小时后，细胞也可以在37°C下恢复指定的时间间隔。然后用抗组蛋白H4高乙酰化形式的兔多克隆抗体和FITC-结合的抗兔山羊抗体对细胞进行染色。显示了典型细胞的共焦激光图像。组蛋白H4在非应激HeLa细胞中的分布显示为对照组（37°C）。
图7。
图7。
热休克导致产生卫星III转录本。（A） 用TSA（1μg/ml；+）或等量乙醇（-）处理HeLa细胞6小时。清洗药物后，将细胞在42°C下加热1小时，并在37°C下恢复1小时。提取总RNA，并使用人类9号染色体异色q1.2带中卫星III序列亚类特异的pHuR98探针在Northern印迹中分析10μg。杂交信号（通宵曝光）与用溴化乙锭染色的凝胶图像一起显示，以显示加载的材料。（B） 将A中描述的相同总RNA与β-actin和hsp70 cDNA探针杂交。（C） 总RNA是从非应激细胞（37°C）或在42°C（42°C）下热休克1小时的细胞中制备的，然后在37°C下恢复指定时间。10μg RNA与pHuR98探针杂交。显示了同一过滤器的两次曝光。作为对照，过滤器也与β-肌动蛋白cDNA杂交。
图8。
图8。
Satellite III转录本与hnRNP HAP在压力体中共定位。HeLa细胞在42°C下热休克1h，然后在37°C下恢复3h。用补充卫星III序列的上链（Sat III Rev 42°C）或下链（Sat-III Dir 42℃）的寡核苷酸原位杂交分析细胞。还将热休克细胞与pBR322序列互补的对照寡聚体杂交（对照42°C）。最后，将Sat III Rev 20-mer与非应力HeLa细胞杂交（Sat III版本37°C）。用荧光素-亲和素显示杂交寡核苷酸的分布。用兔抗HAP多克隆抗体和罗丹明结合山羊抗兔抗体显示hnRNP-HAP在同一细胞中的分布。显示了相同场的共焦激光显微镜图像。
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