KNL-1 directs assembly of the microtubule-binding interface of the kinetochore in C. elegans

doi:10.1101/gad.1126303

.2003年10月1日；17(19):2421-35.

doi:10.1101/gad.1126303。

KNL-1指导秀丽线虫动粒微管结合界面的组装

阿尔沙德·德赛¹, 索尼娅·瑞比纳, 托马斯·穆勒·雷切尔（Thomas Müller-Reichert）, 安德烈·舍甫琴科, 安娜·舍甫琴科, 安东尼·海曼, 凯伦·欧格玛

附属公司

PMID： 14522947
预防性维修识别码： PMC218079型
内政部： 10.1101/编号1126303

KNL-1指导秀丽线虫动粒微管结合界面的组装

阿尔沙德·德赛等。基因开发. 2003.

.2003年10月1日；17(19):2421-35.

doi:10.1101/gad.1126303。

作者

阿尔沙德·德赛¹, 索尼娅·瑞比纳, 托马斯·穆勒·雷切尔（Thomas Müller-Reichert）, 安德烈·舍甫琴科, 安娜·舍甫琴科, 安东尼·海曼, 凯伦·欧格玛

附属

¹马克斯·普朗克分子细胞生物学和遗传学研究所（MPI-CBG），德累斯顿01307，德国。

PMID： 14522947
预防性维修识别码： PMC218079型
内政部： 10.1101/编号1126303

摘要

在细胞分裂过程中，复制的基因组的分离需要动粒，即在有丝分裂染色体上组装的机械化学细胞器，将其连接到纺锤状微管。组蛋白H3变异体CENP-A和保守结构蛋白CENP-C构成动粒组装的DNA近端基础。利用基于RNA干扰的秀丽隐杆线虫基因组学，我们鉴定了KNL-1，这是一种新的动粒蛋白，其缺失，如CeCENP-a或CeCENP-C，导致“动粒缺失”表型。KNL-1位于线性装配层次中CeCENP-A和CeCENP-C的下游。在胚胎提取物中，KNL-1与CeCENP-C表现出亚化学计量相互作用，并与CeNDC-80和HIM-10形成近化学计量络合物，后者是Ndc80p/HEC1p和Nuf2p这两种广泛保守的外动粒组分的线虫同源物。然而，CeNDC-80和HIM-10在功能上并不等同于KNL-1，因为它们的抑制虽然可以防止形成机械稳定的动粒-微管界面并导致染色体错位，但不会导致动粒无表型。KNL-1的更大功能重要性可能是因为它需要靶向外动粒的多个成分，包括CeNDC-80和HIM-10。因此，KNL-1在将CeCENP-a和CeCENP-C启动的动粒组装转化为功能性微管结合界面的形成中起着核心作用。

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数字

**图5。**
KNL-1、CeNDC-80和HIM-10在动粒组装期间表现出不对称依赖性。(A类)野生型，CeNDC-80耗尽(n个=33），HIM-10耗尽(n个=36），且KNL-1耗尽(n个67）胚胎DNA染色(左边面板），CeNDC-80(*中间的*面板）和HIM-10(*正确的*面板）。图中显示了前中期单细胞胚胎的染色体。(B)野生型，CeNDC-80耗尽(n个=37），HIM-10耗尽(n个胚胎DNA染色(左边面板），KNL-1(*中间的*面板）和消耗目标(*正确的*面板）。(C)野生型、KNL-1缺失型、CeNDC-80缺失型和HIM-10缺失型蠕虫提取物的Western blot。加载野生型提取物的系列稀释液以量化消耗水平。

**图1。**
KNL-1缺失导致“动粒细胞”表型。从野生型延时序列中选择的面板(左边柱），KNL-1耗尽(*中间的*列），CeCENP-C耗尽(*正确的*列）显示胚胎。NEBD后的时间（秒）显示在*左上角*每个面板的角。(A类)在GFP-组蛋白H2B和GFP-γ-微管蛋白共存的胚胎中监测染色体分离。对于野生型，每10秒采集一次3D宽场数据集(n个=27），KNL-1耗尽(n个=24），CeCENP-C耗尽(n个=18）胚胎。显示了典型3D电影的时间对齐投影（另请参阅补充视频1-3）。在这些图像中，染色体（0秒面板中的箭头）和中心体（0秒屏幕上的箭头）很容易区分。(B)通过表达GFP-β-微管蛋白的胚胎的单段旋转圆盘共焦成像监测纺锤形态。每6-8秒采集一次野生型图像(n个=27），KNL-1耗尽(n个=32），CeCENP-C耗尽(n个=16）胚胎（另见补充视频4-6）。每种类型的胚胎都有一个与野生型中期同时出现的图像。(C)对14个野生型、15个KNL-1缺失型和12个CeCENP-C缺失型胚胎的纺锤极之间的距离进行跟踪，如A类图中显示了NEBD后平均极间距离与时间的关系。误差条表示S.E.M.，置信区间为0.95。还指出了胞质分裂（所有三种情况）和染色体分离（野生型）的平均开始时间。酒吧：*A、 B类*，10微米。

**图2。**
KNL-1在有丝分裂过程中定位于动粒。(A类)KNL-1是一种1010-氨基酸新蛋白，预测分子量为113 kD。N末端包含一个松散保守序列基序的四个重复（用红色表示并在序列下方对齐）。KNL-1的C端有一个预计会形成螺旋的区域（用蓝色下划线和字母表示）。(B)使用针对KNL-1的两个重叠区域（氨基酸1-150和氨基酸8-256）产生的亲和纯化抗体来探测胚胎提取物的蛋白质印迹。(C)不同细胞周期阶段固定胚胎的投影3D数据集，微管和DNA染色（红色和青色；左边柱）、动粒标记CeCENP-C（第二列）和KNL-1（第三列）。远处的合并图像*正确的*以2.5倍的放大倍数显示CeCENP-C（红色）和KNL-1（绿色）。(D类)高压冷冻/冷冻替代制备的多细胞胚胎中KNL-1的免疫电镜。插图放大2倍。到的示意图*正确的*显示了金粒子在视野中的位置。酒吧：C，10微米；D类500纳米。

**图3。**
KNL-1位于动粒组装层次中CeCENP-A和CeCENP-C的下游。(A类)胚胎被固定并染色以检测微管和DNA（红色和青色；左边面板），CeCENP-C(*中间的*面板）和KNL-1(*正确的*面板）。在CeCENP-C缺失的胚胎中(n个=39），KNL-1没有定位于染色体，尽管纺锤体区域仍然观察到较弱的“基质”染色。在KNL-1缺失的胚胎中，CeCENP-A(n个= 45; 未显示）和CeCENP-C(n个=31）正常定位于动粒。CeCENP-C（Oegema等人，2001）和KNL-1(n个=31个胚胎；未显示）未能针对CeCENP-A缺失的胚胎中的染色体(B)野生型、CeCENP-A缺失型和CeCENP-C缺失型蠕虫的蛋白质印迹。α-管蛋白被用作负荷控制。(C)野生型(左边面板），KNL-1耗尽(*中间的*面板）和CeCENP-C耗尽(*正确的*固定胚胎并染色DNA（红色）和CeCENP-A（绿色）。代表前期(顶部行）和前中期(底部行）显示胚胎。(D类)说明CeCENP-A、CeCENP-C和KNL-1线性装配层次的示意图。CeCENP-A和CeCENP-C之间的关系之前已经确定（Moore和Roth，2001年；Oegema等人，2001年）。酒吧：A类，10微米；C，5微米。

**图4。**
KNL-1与两个广泛保守的外动粒蛋白形成复合物。(A类)胚胎提取物中免疫沉淀物的银染色凝胶。在KNL-1（α-KNL-1_NT2）中一致检测到三条带，但在对照（随机IgG）免疫沉淀物中未检测到（箭头所示）；n个=4提取物）通过质谱鉴定为KNL-1、CeNDC-80和HIM-10。使用第二种KNL-1抗体在免疫沉淀中检测到相同的条带（数据未显示）。污染抗体重链（H）和轻链（L）以及背景带(^*)还显示了。(B)用亲合纯化的CeNDC-80和HIM-10抗体检测胚胎提取物的蛋白质印迹。星号表示未被相应基因的RNAi消除的背景带。分子量标记为200、97.4、66.2、45、31和14.4kD。(C)用所示抗体探测KNL-1免疫沉淀物的蛋白印迹。对四种独立提取物进行免疫沉淀，得到了相同的结果。(D类)CeCENP-C免疫沉淀物的免疫印迹用指示的抗体进行了探测。对两种独立提取物进行免疫沉淀得到相同的结果。在KNL-1或CeCENP-C免疫沉淀物中，银染色均未检测到CeCENP-C。(E类)野生型每10秒采集一次3D宽场数据集(n个=27），KNL-1耗尽(n个=24），CeNDC-80耗尽(n个=21），HIM-10耗尽(n个= 22; 未显示；见补充视频胚胎。显示了典型3D电影的时间对齐投影（另请参阅补充视频7-14）。NEBD后的时间显示在左边以秒为单位。棒材，5μm。(F类)对11个CeNDC-80缺失胚胎的纺锤极之间的距离进行跟踪，如E类图中显示了NEBD后平均极间距离与时间的关系。图1C重新标记了野生型和KNL-1缺失的跟踪数据。误差条表示S.E.M.，置信区间为0.95。还显示了胞质分裂开始的平均时间（所有三种情况）和首次可见染色体分离的平均时间。

**图6。**
KNL-1需要瞄准多个外动粒组件。(A类)用亲和纯化抗体检测胚胎提取物的免疫印迹*秀丽线虫*动粒组分。分子质量标记为200、116.25、97.4、66.2、45和31 kD。(B)在第一次胚胎有丝分裂期间，本研究分析的九种蛋白质定位于动粒时的示意图（补充图1；Oegema等人，2001年）。(C)对野生型和KNL-1缺失的胚胎进行DNA染色(左边每对中的面板）、KNL-1（未显示）和四个动粒标记之一(*正确的*每对面板）。在KNL-1耗尽的所有病例中，免疫荧光检测不到KNL-1（数据未显示）。CeMCAK正常靶向KNL-1缺失胚胎的动粒(n个=63），但CeBUB-1(n个=50），HCP-1(n个=21）和CeCLAP2(n个=19）未能达到目标。(D类)用三种蛋白的抗体探测野生型和KNL-1缺失型蠕虫的Western印迹，这三种蛋白需要KNL-1来靶向动粒。α-管蛋白印迹法被用作负荷对照。(E类)CeBUB-1缺失的胚胎(n个=55），HCP-1和HCP-2(n个=37）或CeCLASP2(n个=33）DNA染色(左边面板），耗尽的组件(*中间的*面板）和KNL-1(*正确的*面板）。KNL-1在所有情况下均正常靶向动粒。(F类)KNL-1免疫沉淀物的蛋白质印迹用针对三种蛋白（CeBUB-1、HCP-1和CeCLASP2）的抗体进行探测，这三种蛋白需要KNL-1进行动粒靶向。KNL-1的控制螺栓面板与图4C中的相同。

**图7。**
有丝分裂后生动物动粒的结构逻辑。(A类)中动粒组装层次的示意图*秀丽线虫*基于表型分析、靶向依赖性和生化数据。KNL-1在CeCENP-a和CeCENP-C启动动粒组装形成功能性微管结合界面过程中起着核心作用。(B)对提议的动粒组装层次的测试。固定野生型和CeNDC-80缺失胚胎并对其进行DNA染色(顶部行）、CeCENP-C（第二行）、KNL-1（第三行）和CeBUB-1(底部行）。野生型和CeNDC-80缺失胚胎的每个动粒标记的暴露是相同的。对图像进行等效处理，以便于比较染色强度。在16个前期和20个前期-早期-后期CeNDC-80缺失的单细胞期胚胎中观察到KNL-1和CeBUB-1染色的类似减少，但CeCENP-C染色没有减少。棒材，5μm。

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