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比较研究
.2003年10月;55(2):61-70.
doi:10.1002/cyto.a.10072。

流式细胞术的细胞内磷酸蛋白染色技术:监测单细胞信号事件

附属公司
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比较研究

流式细胞术的细胞内磷酸蛋白染色技术:监测单细胞信号事件

彼得·奥克鲁茨克等。 细胞计量学A. 2003年10月.
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摘要

背景:细胞内染色技术、细胞仪技术、荧光试剂和抗体产生的最新进展扩大了流式细胞术分析细胞内抗原的数量。用磷酸特异性抗体测量蛋白质磷酸化,可以深入了解激酶信号级联。然而,现有的磷脂酶染色技术可能存在很大差异,因此有必要了解应用此类技术时结果之间的差异,并开发稳健且可重复的应用方法。

方法:对十种不同的细胞固定和渗透技术进行了测试,以确定其提供磷酸特异性染色的能力。将甲醛、甲醇、乙醇、丙酮、Triton X-100和皂苷的混合物用作固定剂和渗透剂。用Alexa荧光染料标记磷特异性抗体,以同时对单个细胞内的不同信号事件进行多色分析。

结果:用1.5%甲醛固定细胞,然后在甲醇中渗透,可获得pERK、pp38、pJNK、pStat1、pStat5和pStat6染色的最佳结果。甲醛固定和甲醇渗透时间的改变影响磷酸化诱导的测量。磷酸特异性流式细胞术分析与Western blotting密切相关,为该技术提供了跨平台验证。

结论:通过流式细胞术测量磷酸化事件提供了一种快速有效的方法来测量单个细胞中的激酶级联。磷酸酯类在甲醇中的稳定性允许在分析之前长期保存样品。通过使用不同的荧光标记,可以同时监测多个信号级联,以确定配体或抑制剂的特异性。将优化技术应用于异种细胞类型,如外周血或小鼠脾细胞,可以同时分析免疫细胞亚群中的信号。

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