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.2003年9月；23(18):6597-608.
doi:10.1128/MCB.23.18.6597-6608.2003。

巨核细胞白血病1是血清反应因子（SRF）的有效转录辅激活因子，是SRF靶基因的血清诱导所必需的

博岑 1, 阿哈莉亚·塞瓦拉吉, 丽贝卡·C·伯吉斯, 约翰·希茨勒, 马志贵, 斯蒂芬·莫里斯, 罗恩·普里维斯
附属公司

巨核细胞白血病1是血清反应因子（SRF）的有效转录辅激活因子，是SRF靶基因的血清诱导所必需的

博岑等。 摩尔细胞生物学. 2003年9月.

摘要

巨核细胞白血病1（MKL1）是一种心肌相关转录因子，我们通过其与血清反应因子（SRF）的直接结合发现了强烈激活的血清反应元件（SRE）依赖性报告基因。c-fos SRE受三元复合因子（TCF）有丝分裂原活化蛋白激酶磷酸化调节，但也受RhoA依赖性途径调节。该途径的机制尚不清楚。由于MKL1（也称为MAL、BSAC和MRTF-A）广泛表达，我们评估了其在血清诱导c-fos和其他SRE调节基因的作用，这些基因具有显性阴性MKL1-突变体（DN-MKL1）和RNA干扰（RNAi）。我们发现DN-MKL1和RNAi通过血清和RhoA特异性阻断SRE依赖性报告基因的激活。RNAi的完全抑制需要额外抑制相关因子MKL2（MRTF-B），显示这些因子的冗余性。DN-MKL1降低了血清诱导内源性c-fos表达的晚期，表明TCF-和RhoA-依赖性途径有助于c-fos的表达在时间上的不同阶段。此外，两个TCF-非依赖性SRE靶基因SRF和vinculin的血清诱导几乎被DN-MKL1完全阻断。最后，急性巨核细胞白血病t（1；22）易位形成的RBM15-MKL1融合蛋白激活SRE报告基因的能力显著增强，表明其激活SRF靶基因可能有助于白血病的发生。

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数字

图1。
图1。
通过MKL1转录激活SRE依赖性启动子，并将SRF与MKL2结合。（A） 利用载体（pcDNA3）或MKL1表达质粒p3×Flag-MKL1（1μg）将SRE依赖或非依赖荧光素酶报告基因（0.5μg）与pRL-SV40P（50 ng）作为内对照瞬时转染HeLa细胞。转染后两天，进行萤光素酶测定，并将其标准化为雷尼利亚荧光素酶控制。这些值表示为MKL1相对于矢量的增加。数据表示为三个独立实验的平均值±标准偏差。α-SA，平滑肌α-actin；α-CA、心脏α-actin；心钠素。（B） 凝胶迁移率变化分析中MKL1与SRF的结合。凝胶迁移率变化分析采用32P标记的寡核苷酸探针，用于高亲和力SRF结合位点（XGL）与细菌表达的SRF（114-508）和/或MKL1的体外翻译产物（在2和3道中分别为5和8μl）或对照翻译裂解物（5μl）的结合，如图所示。（C） MKL1和SRF的免疫共沉淀。将HA标记的SRF和3×标记的MKL1（各2μg）单独转染到HeLa细胞中（与2μg的对照质粒pEGFP-N1一起转染）或按指示一起转染。用抗-HA抗体（顶部）免疫印迹（IB）检测SRF和抗Flag抗体（底部）的免疫沉淀物（IP），并用抗Flug抗体重新标记以确定是否存在Flag标记的MKL1（底部）。用抗HA抗体直接免疫印迹第13次细胞裂解物，以检测HA标记的SRF（中间）。显示HA-SRF、Flag-MKL1和免疫球蛋白重链（Ig）的位置。（D） 内源性SRF和MKL1的免疫共沉淀。用非特异性兔血清（NS）或兔抗SRF或MKL1抗血清免疫沉淀HeLa细胞裂解物，并用抗MKL2血清免疫印迹。对于车道3，使用了1/10的裂解液。相对于标记物，MKL1在160kDa迁移。
图2。
图2。
SRE启动子激活所需的MKL1结构域。（A） MKL1突变体图。所有MKL1突变体在氨基末端都含有一个3×Flag表位。MHD、MKL同源结构域；B、 基本域；Q、 富含谷氨酰胺的结构域。（B） 如图1A所示，使用1×SRE荧光素酶报告子测试所示的MKL1结构体的SRF激活。（C） 用表达载体（0.2μg）瞬时转染HeLa细胞，该表达载体编码融合到GAL4 DNA结合域（氨基酸1至147）和5×GAL4-E1b荧光素酶报告子（0.5μg）的MKL1指示区域，该报告子包含GAL4 DNA结合域的结合位点。荧光素酶活性表示为高于仅用GAL4 DNA结合域观察到的增加，是两个独立实验的平均值±标准偏差。
图3。
图3。
SRF与MKL1突变体的共免疫沉淀。如图1C所示，将HA标记的SRF和指示的标记的MKL1构建物转染到HeLa细胞中，并用抗标记抗体进行免疫沉淀（IP）。两组单独的MKL1突变蛋白在独立实验中与SRF相关联的能力检测结果显示在面板A和B。IB，免疫印迹。
图4。
图4。
显性阴性MKL1抑制SRE的血清和LPA诱导。（A） 用心脏α-actin启动子荧光素酶报告质粒和pRL-SV40P转染MKL1和MKL1C末端缺失突变体的表达质粒（各1μg）。（B和C）HeLa细胞转染C-福斯增强子报告基因或c-福斯在存在或不存在MKL1显性阴性突变体C630（1μg）的情况下，TCF位点（pm18）发生突变的增强子。将转染细胞进行血清饥饿处理，并用血清（B）或LPA（C）诱导3 h-福斯包含c的增强子报告基因-福斯除SRE和TCF站点外，AP1站点（FAP）。所有三个站点都需要进行TPA诱导（65）。用或不使用DN-MKL1 C630突变体转染细胞，并用TPA刺激细胞。（E） 细胞转染GAL4-ELK1和带有或不带有DN-MKL1的5×GAL4位点报告基因。分析细胞裂解物的荧光素酶活性，并对其进行标准化雷尼利亚荧光素酶活性如图1A所示。
图5：。
图5：。
显性阴性MKL1对SRE报告基因RhoA诱导的抑制。HeLa细胞转染有或没有DN-MKL1 C630和RhoA活化形式（RhoA-Val14）（A和B）或活化Raf（RafBXB）和野生型ERK2（各1μg）（C）与图4所示报告基因的组合。（D） 如图所示，用活化的Raf、ERK2和DN-MKL1转染GAL4-ELK1和5×GAL4位点报告基因。
图6。
图6。
MKL1和MKL2的RNA干扰抑制血清和RhoA的激活。（A） 用对照或MKL1特异性pSUPER质粒或GFP或MKL2特异性双链RNA寡核苷酸转染HeLa细胞。细胞代谢标记为[35S] 蛋氨酸和免疫沉淀与抗MKL1或MKL2血清（A，顶部和底部，分别）。（B） HeLa细胞转染a c-福斯增强子报告基因（pm18GL3）与对照组（pSUPER和GFP-siRNA）、pSUPER-MKL1-RNAi、MKL2-siRNA或pSUPER-MKL1和MKL2-RNAi。如图4所示，细胞被血清饥饿并用血清诱导，荧光素酶活性被测量。（C） 与B中一样，除了所示样品与RhoAV14表达载体共转染外，如图5A所示。
图7。
图7。
显性阴性MKL1抑制内源性SRF靶基因。（A） 用载体pcDNA3或MKL1显性阴性突变体C630（4μg）转染HeLa细胞，条件是转染率大于90%，与0.5μg GFP表达载体pEGFP-N1共转染证实了这一点（数据未显示）。在用20%新生小牛血清刺激细胞之前，将细胞血清饥饿24小时，达到指定时间。制备总RNA-福斯，c-六月和RNase保护分析检测到的亲环素。（B） c-福斯A中的核糖核酸酶保护带用磷成像仪定量，并归一化为亲环素表达水平。（C至G）用空逆转录病毒载体（pBabe-puro）或驱动C630在NIH 3T3小鼠成纤维细胞中表达的载体生成细胞系。细胞被血清饥饿，并用20%的血清处理指定时间-福斯（C） 通过RNase保护检测SRF和vinculin（E）和对照酸性核糖体磷酸蛋白-P0（ARPP-P0）mRNA。用荧光成像仪对信号进行量化，用c-福斯（D） 、SRF（F）和vinculin（G）表达水平归一化为ARRP-P0。定量结果是三次测定的平均值±标准偏差。
图8。
图8。
RBM15-MKL1融合蛋白激活SRE报告基因的能力显著增强。（A） 将指示的报告基因（0.5μg）转染HeLa细胞，pRL-SV40P（50 ng）作为内对照，载体pcDNA3、1×Flag-RBM15、1×Flag-MKL1或1×Flage-RBM15-MKL1（1μg）。对细胞裂解物进行萤火虫萤光素酶活性测定，并对其进行标准化雷尼利亚荧光素酶活性。显示了三次测定的平均值±标准偏差。（B和C）HeLa细胞转染C-福斯如图所示，启动子荧光素酶基因具有或不具有增加数量的1×Flag-MKL1或1×Flage-RBM15-MKL1表达质粒。细胞裂解物通过抗标记抗体免疫印迹分析荧光素酶活性（B）和蛋白质表达（C）。
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