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.2003年7月21日；162（2）：199-209年。
doi:10.1083/jcb.200302060。 Epub 2003年7月14日。

通过急性抑制破裂PC12细胞的分泌鉴定突触素效应物

病房C塔克 1, J迈克尔·爱德华森, 白继洪, 金贤中, 托马斯·F·J·马丁, 埃德温·查普曼
附属公司

通过急性抑制破裂PC12细胞的分泌鉴定突触素效应物

病房C塔克等人。 J细胞生物学. .

摘要

突触蛋白（synaptogmins，syts）是一个膜蛋白家族，被认为可以调节神经元和非神经元细胞的膜交通。在神经元中，syt I的钙感应能力对于对接突触小泡与质膜融合以响应刺激至关重要。已经确定了几个假定的Ca2+-syt效应器，但在大多数情况下，这些相互作用的功能意义仍然未知。在这里，我们使用了来源于syts I-XI细胞质域的重组C2结构域来干扰断裂PC12细胞Ca2+触发胞吐期间的内源性系统效应器相互作用。抑制作用与合成蛋白SNAP-25和磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2）结合活性密切相关。此外，我们测量了PC12细胞内源性syts的表达水平；主要的异构体是I和IX，其中痕量VII。正如预期的那样，如果syts I和IX作为Ca2+传感器发挥作用，那么来自这些亚型的片段会阻止分泌。这些数据表明，syts通过与t-SNARE和PIP2（已知在胞吐中起关键作用的靶分子）的Ca2+调节相互作用触发融合。

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数字

图1。
图1。
筛选syt I–IX的C2A结构域以抑制胞吐。（A） 胞吐过程中syt功能的模型；钙2+–syt通过与效应分子的相互作用触发释放。添加来自不同syt亚型的外源C2结构域与内源syt竞争效应器相互作用，从而抑制融合。（B） 来源于系统I-XI的C2A结构域表现出不同的能力来阻断PC12细胞释放儿茶酚胺。用100μM CaCl触发释放前1分钟，将指示的C2A结构域（10μM）添加到反应室2.对缺乏重组蛋白（仅缓冲液）的对照样品进行平行分析，并用于计算抑制率。我们注意到一些实验是在最低[Ca2+]我们可以可靠地测量分泌物；在这些实验中，syt III和VII的C2A结构域表现出与100μM Ca时观察到的相同的抑制活性2+（未发布的数据）。（C） 在释放过程中，C2A-III和C2A-VII始终会抑制儿茶酚胺的释放。在指定时间添加C2A-I、-III和-VII（10μM）（相对于Ca2+添加）。对于每个定时实验，释放曲线与控制轨迹（仅缓冲区）叠加。
图2。
图2。
C2A结构域对分泌的抑制与PIP相关2-结合活性。将所示C2A亚型（0.13 nmole）的GST融合物固定在谷胱甘肽-脑葡萄糖珠上，并对其进行检测三在2 mM EGTA（白条）或100μM Ca存在下结合H标记脂质体2+（黑色条），如材料和方法中所述。（A） 项目实施计划2-syt I–XI中C2A的结合特性。脂质体由1.5%的PIP组成2/98.5%PC。（B）绘制抑制程度（图1B）与PIP的程度2-100μM Ca下的结合活性2+（A） ●●●●。数据采用线性回归拟合；第页2报告值和P值。（C） syt I–XI中C2A的PS结合特性。脂质体由25%PS/75%PC组成。（D）绘制了抑制程度（图1B）与100μM Ca下PS-结合活性的对比图2+（C） ●●●●。注意，C2A-I和-II表现出强大的PS-结合活性，但未能抑制释放。（E） C2A–PS/PC脂质体相互作用的动力学研究。如前所述，使用C2A中天然色氨酸残基（供体）与脂质体中加入的丹酰-PE（受体；5%与25%PS/70%PC）之间的荧光共振能量转移来监测C2A–PS/PC膜相互作用的时间进程（Davis等人，1999）。通过与脂质体（11 nM[最终]）和Ca快速混合，获得每个C2A（3μM[最后]）的动力学痕量2+（100μM[最终]）。观察到的速率(k个 光突发事件)通过用C2A-I和-III的单一指数函数拟合数据来确定；C2A-VII的数据最好用双指数函数拟合。（插图）k个 光突发事件绘制为指示脂质体浓度的函数。注意k个 光突发事件C2A-VII的较慢组分（○）不依赖于脂质体浓度，这表明它代表了C2A-脂质体复合物组装后的构象变化或复杂重排，例如齐聚（Fukuda和Mikoshiba，2001；Wu等人，2003）；这里只考虑快速分量（•）。误差条表示三个独立实验的SD。（F） 项目实施计划2增强C2A-III和C2A-VII对膜的亲和力，但不增强C2A-I。的值k个 远离的,k个 在、和K（K） D类如前所述计算C2A与脂质体的相互作用（Davis等人，1999年）。C2A-I、-III和-VII与含有25%PS（含70%PC和5%丹酰-PE）的脂质体结合，具有相似的速率常数和亲和力，而C2A-III和-VII表现出三到四倍的低K（K） D类含1.5%PIP的脂质体2和25%PS（含68.5%PC和5%丹酰-PE）。
图3。
图3。
抑制性C2A结构域结合t-SNARE。（A） t-SNARE–来源于syts I–XI的C2A域的结合剖面。固定化GST–C2A融合物（20μg在150μl HBS中+0.5%Triton X-100）和5μM t-SNARE异源二聚体在2 mM EGTA（−Ca2+)或1mM氯化钙2（+钙2+). 对20%的结合蛋白和3%的总t-SNARE进行SDS-PAGE并用考马斯蓝染色。（B） C2A结构域表现出不同程度的钙2+-依赖t-SNARE绑定。用密度计对A中显示的t-SNARE结合分析进行定量，并绘制钙存在（黑条）或不存在（白条）时的相对光密度（O.D.）2+C2A结构域抑制儿茶酚胺释放与t-SNARE结合相关。将抑制百分比绘制为Ca的函数2+-依赖t-SNARE绑定。
图4。
图4。
Syts I和IX是PC12细胞中的主要syt亚型。（A） 与系统III、IV、VII和IX的指示区域相对应的肽用于产生材料和方法中所述的多克隆抗体。（B） 抗钇（α-syt）抗体的特异性。对100 ng缺失C2B结构域（αI、III、IV和VII）或仅由细胞质结构域（a-IX）组成的所示GST-syt片段进行SDS-PAGE，转移到硝化纤维素中，并用所示抗体进行检测。使用截短的syt片段是因为与全长syt相比，它们相对容易表达和分离。由于细菌的表达，重组蛋白制剂通常含有多个蛋白水解片段；重组标准物的定量基于与完整蛋白质分子量相对应的条带丰度。每一种抗体都对其所针对的系统具有特异性。对于αI，使用了单克隆抗体41.1（Chapman和Jahn，1994）。（C） PC12细胞中Syt表达水平。使用所示抗体对所示数量的重组标准物和核后PC12细胞膜（总蛋白）进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。（D） Syt VII是低丰度钙2+PC12单元中的传感器。如C所述，对系统III、IV和VII进行免疫印迹，减少标准物的数量，增加细胞膜的数量。（E） C和D中所示的斑点通过密度测定法进行量化，并绘制成膜总蛋白的百分比。由于每个表达的亚型都检测到多条带，因此定量是基于细胞提取物的总免疫反应性，将所有带的密度相加。（F） 抗syt-III和-7抗体可检测成纤维细胞中表达的syt III和VII。用syt亚型I、III或VII（+）或空载体（−）的表达构建物（pCI-neo；Promega）转染HEK细胞，并用其各自的抗体进行检测。
图5。
图5。
来自syt I和syt IX的C2B和C2A-C2B结构域抑制胞吐。如图1B所示，对syt亚型I和IX的C2A、C2B和C2A-C2B结构域（10μM）进行抑制胞吐的能力分析。
图6。
图6。
项目实施计划2-结合活性和胞吐抑制作用与syts I和IX的C2B结构域相关并定位。（A） 如图2 C的图例所述，对所示syt I/IX结构体的PS结合活性进行了分析。（B）PS结合活性与分泌抑制无关。儿茶酚胺释放抑制百分比（图5）绘制为Ca的函数2+-依赖于PS/PC脂质体结合活性，并通过线性回归拟合。对于系统I和系统IX，PS结合不是抑制所必需的，因为C2B结构域与PS结合较弱，但抑制释放。（C） 项目实施计划2-如图2 A（D）PIP图例所示，对所示syt I/IX结构的结合活性进行分析2结合与分泌抑制有关。将抑制率（图5）绘制为Ca的函数2+-依赖PIP2结合（C）并通过线性回归拟合。
图7。
图7。
syt I和IX的抑制片段结合t-SNARE。（A） 将来自系统I和系统IX的GST-C2A、-C2B或-C2A-C2B（3μM）固定在小球上，并在EGTA（2 mM）或Ca的存在下，按照材料和方法中的描述，测定t-SNARE异二聚体-（5μM）结合活性2+（1毫微米）。考马斯蓝染色显示蛋白质。（B） t-SNARE结合活性的定量通过A.EGTA中所示条带的密度测定法确定，白色条带；钙2+，黑色条。（C） 分泌抑制与t-SNARE结合活性相关。抑制率（图5）绘制为Ca的函数2+-依赖性t-SNARE–结合活性（B）。（D） syt I和IX与t-SNARE的共免疫沉淀。可溶性syt片段（2μM）与可溶性t-SNARE异二聚体（2μM）在2 mM EGTA或1 mM Ca中孵育2+1小时后，通过添加单克隆抗体HPC-1和蛋白G–Sepharose免疫沉淀Syntaxin。免疫沉淀物进行SDS-PAGE；凝胶用考马斯蓝染色。（E） 通过共免疫沉淀测定t-SNARE结合的定量。如B（F）所述，通过密度测定法进行定量。抑制百分比（图5）绘制为Ca的函数2+-依赖性t-SNARE结合由大肠杆菌共免疫沉淀测定。
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参考文献

    1. Augustine，G.J.2001年。钙是如何触发神经递质释放的？货币。操作。神经生物学。11:320–326.-公共医学
    1. Bai，J.和E.R.Chapman。2003.应用荧光探针研究Ca2+触发的突触结合蛋白C2结构域-膜相互作用的力学和动力学。方法酶制剂。360:238–258.-公共医学
    1. Bai，J.、P.Wang和E.R.Chapman。2002.C2A激活突触球蛋白I的C2B结构域内一种隐蔽的Ca2+触发的膜渗透活性。国家。阿卡德。科学。美国99:1665–1670。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Bollmann、J.H.、B.Sakmann和J.G.Borst。2000.花萼型末端谷氨酸释放的钙敏感性。科学。289:953–957.-公共医学
    1. Bommert，K.、M.P.Charlton、W.M.DeBello、G.J.Chin、H.Betz和G.J.Augustine。C2-域肽对神经递质释放的抑制意味着突触结合蛋白参与胞吐。自然。363:163–165.-公共医学

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