Molecular mechanism of signal sequence orientation in the endoplasmic reticulum

doi:10.1093/emboj/cdg361

.2003年7月15日；22(14):3645-53.

doi:10.1093/emboj/cdg361。

内质网信号序列定向的分子机制

Veit Goder公司¹, 马丁·施皮斯

附属公司

PMID： 12853479
预防性维修识别码：下午165631
内政部： 10.1093/emboj/cdg361

内质网信号序列定向的分子机制

Veit Goder公司等。欧洲工商管理硕士J. 2003.

.2003年7月15日；22(14):3645-53.

doi:10.1093/emboj/cdg361。

作者

Veit Goder公司¹, 马丁·施皮斯

附属

¹瑞士巴塞尔大学Biozentrum，Klingelbergstrasse 70，CH-4056 Basel。

PMID： 12853479
预防性维修识别码：项目经理165631
内政部： 10.1093/emboj/cdg361

摘要

我们在体内分析了模型信号序列在同翻译整合到内质网的过程中是如何插入膜并定向的。该结果与目前的保留正侧翼电荷或多肽环插入转座子的模型不一致。相反，他们指出，这些N端信号最初与细胞质C端迎面插入，然后反转方向以转位C端。反转速率随N端正电荷的增加而增加，随信号疏水性的增加而降低。当信号相关进程终止反转时，反转可能会持续约50秒。这些发现为侧翼电荷和信号疏水性的拓扑效应提供了一种机制。

PubMed免责声明

数字

**图1。**转座子信号定向的潜在机制。(A类)在转座子处或其附近，通过与胞质侧的负电荷相互作用，保持信号的更积极的侧翼序列。(B类)多肽环插入，然后反向信号倒置，即N末端为负的锚定。(C类)迎头插入，随后反转可切割信号和II型信号——具有更积极的N端侧翼序列的锚。为了简单起见，省略了SRP受体。信号序列示意图绘制为螺旋线；然而，在靶向和再定向过程中，其构象未知。

**图2。**研究膜蛋白拓扑学的模型蛋白。(A类)嵌合模型蛋白H1ΔLeu22由具有230个残基的C端结构域的N端信号锚定序列组成。如示意图所示，它插入两个方向(B类)。C末端结构域包含两个诊断性糖基化位点（圆圈），它们在移位到内质网腔时被核心糖基化。(C类)将转染的COS-1细胞标记为[³⁵S] 甲硫氨酸40分钟，然后使用针对非常C-末端序列的抗体进行免疫沉淀（开盒），SDS–凝胶电泳和放射自显影，糖基化和内糖苷酶H（EH）敏感的N_细胞周期/C类_{外显（exo）}形态很容易与未糖基化氮区分开来_{外显（exo）}/C类_细胞周期形式。显示了附加聚糖的数量。细胞质；外来的，外来的。

**图3。**信号方向取决于蛋白质的大小。(A类)具有不同C末端结构域长度的结构体H1ΔLeu22[#]的示意图。所有结构都共享H1ΔLeu22的信号和以下96个氨基酸以及免疫沉淀的C末端表位（开盒）。(B类)这些结构物在COS-1细胞中表达，标记为[³⁵S] 蛋氨酸40min，免疫沉淀，SDS-凝胶电泳（左侧和右侧凝胶分别为14%和10%聚丙烯酰胺）和磷光成像分析。显示了分子量标记15、20、26、37、50和64kDa（左）以及61和84kDa的位置。(C类)使用磷光成像仪分析定量含有糖基化并因此移位的C末端的多肽部分。绘制了三个实验（包括B中所示的实验）的平均偏差和标准偏差与C末端结构域长度的关系。

**图4。**糖基化状态反映蛋白质拓扑结构。(A类)碱提取：表达H1ΔLeu22[110]、[170]、[230]或分泌蛋白H20-的COS-1细胞被标记为[³⁵S] 蛋氨酸，并进行碱性萃取。离心后，通过免疫沉淀、SDS-凝胶电泳和放射自显影术分析颗粒（P）和上清液（S）以及等分的总起始物质（T）。(B类)蛋白酶保护：表达H1ΔLeu22[110]、[170]、[230]或野生型H1的COS-1细胞被标记为[³⁵S] 蛋氨酸，通过肿胀和刮擦破碎，用或不用胰蛋白酶（Tryp）和Triton X-100（TX）培养。然后抑制胰蛋白酶，并通过免疫沉淀、SDS-凝胶电泳和放射自显影术分析蛋白质。由于破碎的细胞在没有蛋白酶抑制剂的情况下在4°C下培养，一些未糖基化的多肽甚至在没有添加胰蛋白酶的情况下也会丢失，很可能是由于溶酶体蛋白酶的释放。(C类)蛋白质稳定性：表达H1ΔLeu22[170]或[460]的COS-1细胞被脉冲标记40分钟[³⁵S] 蛋氨酸并用过量的未标记蛋氨酸追赶0–90分钟。脉冲和追逐均在存在（+CHX）或不存在（–CHX）1µg/ml环己酰亚胺的情况下进行。通过免疫沉淀、SDS-凝胶电泳和放射自显影术分析蛋白质。对糖基化和非糖基化产物进行定量后，按分钟计算其半衰期。半衰期用于校正C末端易位多肽在标记期间的降解表观分数。校正将H1ΔLeu22[170]的值从36%更改为31%，在没有环己酰亚胺的情况下，H1△Leu22[460]的值分别从51%更改为48%，在有环己酰酮的情况下分别从77%更改为74%和73%更改为71%。因此，蛋白质降解不会显著扭曲结果。

**图5。**拓扑取决于转换时间。将表达H1ΔLeu22[110]（三角形）、H1△Leu22[270]（圆形）或H1△Luu22[230]（矩形）的COS-1细胞标记为[³⁵S] 蛋氨酸中存在不同浓度的环己酰亚胺。标记蛋白进行免疫沉淀，并通过凝胶电泳和放射自显影术进行分析。蛋白质定向通过磷成像仪分析定量，并绘制成环己酰亚胺浓度的函数。显示了三次测定的平均值和标准偏差。

**图6。**～50秒后信号反转停止。在存在1µg/ml环己酰亚胺的COS-1细胞中表达H1ΔLeu22[#]结构体，并如图3所示进行分析。(A类)蛋白质取向通过磷成像仪分析进行量化，并以开平方作为C末端结构域长度的函数绘制(B类)或作为翻译时间的函数(C类)。根据总信号的减少，在1µg/ml环己酰亚胺存在下的伸长率降低了1.8倍。为了进行比较，在没有环己酰亚胺的情况下测定的蛋白质取向（见图3C）显示为填充正方形。显示了三次测定的平均值和标准偏差。

**图7。**侧翼电荷和疏水性决定了信号反转的速度。从构建序列H1ΔLeu22[#]（面板F）开始，进一步分析信号序列疏水性增加或减少和/或N端正电荷增加或减少的蛋白质序列。蛋白质取向与翻译时间的关系如图6C所示。显示了N-末端氨基酸序列和寡亮氨酸片段的长度。实验在没有（填满的方块）或存在1µg/ml环己酰亚胺（开方块）的情况下进行。箭头表示信号反转停止的时间。每个值表示至少两次单独测定的平均值。

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1. Beltzer J.P.、Fiedler，K.、Fuhrer，C.、Geffen，I.、Handschin，C.、Wessels，H.P.和Spiess，M.（1991）带电残基是信号锚序列跨膜方向的主要决定因素。生物学杂志。化学。，266, 973–978.-公共医学
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[1] Andrews D.W.、Young，J.C.、Mirels，L.F.和Czarnta，G.J.（1992）《N区在信号序列和信号锚定功能中的作用》。生物学杂志。化学。，267, 7761–7769.-公共医学

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[9] Connolly T.和Gilmore，R.（1993）信号识别颗粒和信号识别颗粒受体复合物的GTP水解。细胞生物学杂志。，123, 799–807.-项目管理咨询公司-公共医学

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