High threshold for induction of the stress response in motor neurons is associated with failure to activate HSF1

doi:10.1523/JNEUROSCI.23-13-05789.2003

.2003年7月2日；23(13):5789-98.

doi:10.1523/JNEUROSCI.23-13-05789.2003。

运动神经元应激反应诱导的高阈值与HSF1激活失败有关

扎拉·巴图兰¹, 盖尔A Shinder, 桑德拉·米诺蒂, 北平河, 穆罕默德·多卢奇, 约瑟芬·纳尔班托格鲁, 迈克尔·斯特朗, 希瑟·D·达勒姆

附属公司

PMID： 12843283
预防性维修识别码： PMC6741252型
内政部： 10.1523/JNEUROSCI.23-13-05789.2003年

运动神经元应激反应诱导阈值高与HSF1激活失败相关

扎拉·巴图兰等。神经科学. 2003.

.2003年7月2日；23(13):5789-98.

doi:10.1523/JNEUROSCI.23-13-05789.2003。

作者

扎拉·巴图兰¹, 盖尔A Shinder, 桑德拉·米诺蒂, 北平河, 穆罕默德·多卢奇, 约瑟芬·纳尔班托格鲁, 迈克尔·斯特朗, 希瑟·D·达勒姆

附属

¹加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学蒙特利尔神经病学研究所及神经病学和神经外科系H3A 2B4。

PMID： 12843283
预防性维修识别码： PMC6741252型
内政部： 10.1523/欧洲科学.23-13-05789.2003

摘要

热休克蛋白70（Hsp70）保护培养的运动神经元免受Cu/Zn-超氧化物歧化酶（SOD-1）突变的毒性影响，SOD-1是导致肌萎缩侧索硬化（ALS）家族性疾病的原因。在这里，研究了运动神经元的内源性热休克反应，以确定激活这种保护机制的高阈值是否有助于其易受与ALS相关的应激的影响。当热休克时，培养的运动神经元不能表达Hsp70或反式表达由Hsp70启动子驱动的绿色荧光蛋白报告基因，尽管Hsp70在胶质细胞中被诱导。暴露于兴奋毒性谷氨酸或突变SOD-1表达后，运动神经元中的Hsp70没有增加，G93A SOD-1转基因小鼠或散发或家族性ALS患者的脊髓中的Hps70也没有增加。相反，当组成活性形式的热休克转录因子（HSF）-1表达或蛋白酶体活性被充分抑制以诱导替代转录因子HSF2的积累时，运动神经元发生强烈的Hsp70诱导。这些结果表明，运动神经元中诱导应激反应的高阈值源于激活主要热休克应激传感器HSF1的能力受损。

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数字

**图1。**
热休克诱导脊髓培养中的Hsp70。将脊髓培养物置于升高的热休克温度（40–42°C）下1小时，然后在37°C下恢复2小时。以HSPs[Hsp70（SPA-810）、Hsp25（SPA-801）、Hsc70（K19）和αB-crystallin（SPA-222）]抗体和肌动蛋白作为负荷对照，进行Western blot检测。所示斑点代表三个不同的实验。只有Hsp70上调。

**图2。**
热休克后，神经胶质细胞（而非运动神经元）上调Hsp70。一个——D类，将脊髓培养物置于37°C的控制温度下(一个)或42°C热冲击(B类——D类)1小时，然后在37°C下恢复2小时。用生物素结合二级抗体和DAB作为底物，通过免疫细胞化学方法评估Hsp70的诱导作用(*A、 B类*)或荧光结合二级抗体(C类). 热曲棍球脊髓培养物也被GFAP抗体双重标记(D类)验证胶质细胞诱导Hsp70。箭头在一个指向运动神经元。比例尺：*A、 B*，50微米；*C、 D类*，20微米。

**图3。**
运动神经元对谷氨酸的反应不能表达Hsp70。一个——如果，脊髓培养物用50μ米谷氨酸(*B、 D、F*)或车辆(*A、 C、E*)30分钟，然后通过免疫细胞化学（SPA-810）评估Hsp70诱导。硝基酪氨酸标记表明谷氨酸处理对运动神经元有影响(*E、 F类*). 比例尺，20μm

**图4。**
热休克蛋白在G93A突变SOD-1转基因小鼠腰椎脊髓中的表达。用Hsp70（SPA-810）、Hsp25（M20；识别灵长类Hsp27和啮齿动物Hsp25）、GFAP、MAC-1或αB-crystallin抗体标记80、92和115日龄小鼠的20μm腰椎脊髓切片。未观察到Hsp70的诱导(一个——C类). 运动神经元组成性表达Hsp25(D类——如果)，但在疾病进展过程中未发现任何质量变化。随着年龄的增长，表达Hsp25的星形胶质细胞逐渐增多(*G公司*——我). 115天龄非转基因小鼠组成性表达αB-晶体蛋白的运动神经元(*P（P）*). 在115天龄有症状的G93A SOD-1转基因患者的腰椎中，在一些但不是所有的反应性星形胶质细胞中检测到αB-晶体蛋白(*Q、 R（右）*). 通过GFAP的表达鉴定反应性星形胶质细胞和小胶质细胞(*J、 K、L、R*)和MAC-1(*M（M）*——哦)分别标记相邻部分。比例尺：一个——*C、 G–R公司*，40微米；*D–F型*，15.4微米。

**图5。**
G93A SOD-1转基因小鼠中Hsp25随年龄和疾病进展而增加。一个，野生型和G93A SOD-1小鼠脊髓匀浆的蛋白质印迹上Hsp25的定量。将转基因小鼠样品中Hsp25与微管蛋白的比率归一化为非转基因同卵鼠匹配样品中的比率。注意，有症状的G93A SOD-1小鼠中Hsp25的增加是44日龄小鼠的三倍。有症状的动物脊髓中Hsp25的平均水平也高于无症状的室友。在免疫印迹上未检测到诱导型Hsp70（我们未发表的数据）。所示为每组3至9只动物的平均值±SD。星号表示与所有其他值存在显著差异；第页≤ 0.05 (t吨测试；单尾；不等方差）。B类，在115天龄G93A SOD-1小鼠和年龄匹配的非转基因同窝小鼠的腰椎脊髓匀浆的Western blot上定量αB-晶体蛋白免疫标记物相对于微管蛋白。

**图6。**
HSP在对照组、散发组和FALS（A4V SOD-1突变）颈脊髓中的表达。对照组脊髓运动神经元和前角神经突起中检测到Hsp27(一个)，零星(B类)、和FALS(C类)患者；箭头在C类指向包含布尼娜体的脊髓运动神经元。FALS运动神经元胞浆中未观察到Hsp70免疫标记(D类)或偶发性ALS（我们未公布的数据）。神经膜中的Hsp27标记(E类)不符合GFAP免疫反应模式(如果). 比例尺：一个，100微米；B类，40微米；C类——如果，20微米。

**图7。**
运动神经元表达热休克转录因子HSF1和HSF2。一个用HSF1单克隆抗体（SPA-950）标记原代脊髓培养物中的运动神经元和其他细胞。B类，用蛋白酶体抑制剂MG132（0.1μ米)导致HSF2积累并转移到包括运动神经元在内的脊髓细胞的细胞核中（1，2）。MG132（1μ米)以DAB为底物（3,4），免疫细胞化学检测到Hsp70（SPA-810）的强表达。箭头表示运动神经元。比例尺，30μm。

**图8。**
表达活化的HSF1，但不表达HSF1^重量，通过基因转移诱导运动神经元中HSP70的表达。*A、 B类*，运动神经元微注射编码HSF1的质粒表达载体^重量，组成激活的HSF1（HSF1⁽⁺⁾)，或非激活HSF1（HSF1^（-）). 48小时后，运动神经元注射HSF1^重量热休克（42℃；1小时）或对照条件（37℃；1 h），并在37℃下恢复2小时。所有培养物均用HSF1和Hsp70抗体双重标记。一个，虽然运动神经元表达HSF1^重量（1,2）在与HSF1相当的水平⁽⁺⁾（3），仅限HSF1⁽⁺⁾诱导Hsp70（5-7）。B类、HSF1和Hsp70共存的运动神经元百分比(n个每组≥4个培养基）。强Hsp70免疫标记仅在注射了*高铁1号线⁽⁺⁾*在其他三种情况下，在细胞核中经常观察到低强度标记（§）。仅限HSF1⁽⁺⁾显著增加表达Hsp70的运动神经元的百分比(t吨测试；单尾；不等方差；第页< 0.0001).C类，高速一级⁽⁺⁾也导致运动神经元中在Hsp70启动子控制下的GFP报告基因的强烈表达。左，运动神经元注射右旋糖酐TMR标记物和GFP载体，分别在热休克前和热休克后2小时进行成像。对，与HSF1的共表达相比，热休克未能诱导GFP（5）⁽⁺⁾导致GFP强烈表达（6）。比例尺，30μm。

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