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.2003年6月9日；161（5）：899-909。
doi:10.1083/jcb.200302125。 Epub 2003年6月2日。

一个基因编码的荧光报告显示蛋白激酶C的振荡磷酸化

乔纳森·D·小提琴 1, 金章（Jin Zhang）, 钱永健, 亚历山大·牛顿
附属公司

一个基因编码的荧光报告显示蛋白激酶C的振荡磷酸化

乔纳森·D·小提琴等。 J细胞生物学. .

摘要

激酶转导的信号取决于底物磷酸化的程度和持续时间。我们为PKC活性生成了基因编码的荧光报告物，该荧光报告物对激活PKC的刺激作出可逆反应。具体而言，哺乳动物细胞中表达的报告基因的磷酸化会导致荧光共振能量转移（FRET）的变化，从而可以实时成像PKC激活引起的磷酸化。将报告基因靶向激活PKC的质膜，揭示了HeLa细胞对组胺的振荡磷酸化反应。底物磷酸化中的每一个振荡都伴随着大约10秒的钙振荡。PKC易位、磷酸肌醇二磷酸转化为IP3、，和二酰基甘油表明，在HeLa细胞中，振荡磷酸化与Ca2+控制的传统PKC向膜的移位相关，而没有PLC活性或二酰基丙三醇振荡。然而，在ATP刺激的MDCK细胞中，PLC和二酰甘油与Ca2+和磷酸化一起波动。因此，PKC信号的特异性取决于激酶和磷酸酶活性之间的局部第二信使控制的平衡，从而导致严格的钙控制的底物磷酸化的时间调节。

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图1。
图1。
生成CKAR。（A） CKAR由mCFP、Rad53p的FHA2结构域、PKC底物序列和mYFP组成。当磷酸化时，底物序列与FHA2磷酸肽结合结构域结合。这种构象变化导致FRET发生变化，可被磷酸酶逆转。（B） 体外CKAR被PKC磷酸化.时间进程32P掺入镍纯化组氨酸标记的CKAR中，通过切除的考马斯蓝染色带的闪烁计数测量。（插图）考马斯蓝染色纯化CKAR（顶部）和32P放射自显影术（底部）。（C） CKAR在30°C下孵育30分钟，添加或不添加纯化PKCβII的发射光谱。在434nm处的激发导致CFP发射峰（476nm）和YFP发射峰，这是由来自CFP的FRET引起的（528nm）。PKC磷酸化导致528nm处强度降低，476nm处强度增加，与FRET降低一致。将CKAR与胰蛋白酶在30°C孵育30分钟，可破坏YFP发射，表明FRET是由分子内能量转移引起的。（D） 与活性钙调素依赖性激酶II（CaMKII）或cAMP依赖性激酶（PKA）孵育，FRET无变化。
图2。
图2。
CKAR是活细胞中PKC活化的一种特异性可逆报告子。（A） 用200 nM PDBu刺激PKC后，HeLa细胞中表达的CKAR被磷酸化。通过添加500 nM Go6983（PKC的一种特异性抑制剂）可逆转这种情况。（B） CKAR磷酸化对PKC具有特异性。（黑色）PKC被200 nM PDBu激活，并被1μM Go6983抑制。（红色）DMSO（PDBu车辆）和10μM forskolin均未引起FRET变化。（绿色）PKC（1μM Go6983）的预抑制不会改变基础FRET，而FRET通过thapsigargin释放细胞内钙来刺激其他钙敏感激酶，如CaMKII而保持不变。（C） 用200 nM PDBu对PKC进行最大峰上刺激可导致CKAR的稳定磷酸化，但用100 nM花萼蛋白A抑制磷酸酶可导致额外的磷酸化。数据来自同一视野中的两个单元格。（D） 细胞溶质（红色）和细胞核（黑色）中CKAR的磷酸化显示PDBu后优先进行细胞溶质磷酸化，但在花萼蛋白A处理后磷酸化更大且更均匀。（E） 图2D对应的图像显示了PDBu（20'）、PDBu和calyculin（40'）后CKAR的磷酸化（假彩色FRET比率图像的红移，顶部）。YFP强度图像（底部）表明在实验过程中CKAR定位没有变化。（F） CKAR的设计PKC底物中苏氨酸磷酸受体的突变阻止了响应200 nM PDBu或100 nM calyculin的FRET变化。（G） CKAR对受体介导的PKC激活也很敏感。10μM组胺导致HeLa细胞中CKAR的快速磷酸化。所有数据均代表至少三个实验。
图3。
图3。
将CKAR靶向质膜。（A） CKAR通过融合10个氨基酸NH靶向质膜2激酶Lyn到NH的末端2CKAR的末端，编码肉豆蔻酰化和棕榈酰化。（插图）HeLa细胞中表达的MyrPalm-CKAR图像，显示CKAR有效靶向质膜。（B） 用200 nM PDBu对PKC的最大限度刺激导致CKAR几乎完全磷酸化，因为用100 nM calyculin A抑制磷酸酶只导致轻微的额外磷酸化。（C） MyrPalm-CKAR磷酸化在10μM组胺后振荡，并被1μM Gö6983抑制。（D） 图3 C的扩展时间范围。（E）用1μM Gö6983进行预处理可通过10μM组胺阻止MyrPalm-CKAR磷酸化。（F） 苏氨酸磷酸受体突变为丙氨酸（T413A）使MyrPalm-CKAR对10μM组胺无反应。所有数据均代表至少三个实验。振荡磷酸化虽然变化很大，但在10–20%的研究细胞中检测到，在12个以上的不同实验中在30多个细胞中观察到。
图4。
图4。
MyrPalm-CKAR振荡磷酸化与钙振荡相对应。（A） 钙（呋喃红强度，红色）和MyrPalm-CKAR磷酸化（CFP-YFP FRET，黑色）表明，MyrPall-CKAR的磷酸化直接对应于钙瞬变。（B） 平均A中的钙和磷酸化峰值表明，在钙瞬变开始后，MyrPalm-CKAR磷酸化持续滞后10-20秒。对每个Fura红强度峰值的时间进行标准化，并对该固定时间周围每次图像采集的Fura红亮度和FRET比率进行平均。（C） 对表达MyrPalm-CKAR T413A的HeLa细胞的组胺刺激表明，FRET的变化几乎完全不依赖于Fura红信号的光谱重叠，而依赖于MyrPall-CKAR PKC底物中的磷酸受体T413。（D） 组胺刺激导致钙振荡并不导致细胞溶质CKAR的振荡磷酸化。所有数据均代表至少三个实验。在八个实验的15个不同细胞中发现了锁相钙和磷酸化振荡。
图5。
图5。
组胺诱导PKC易位振荡。（A） YFP融合到PKC的两个末端，作为CFP的FRET受体，融合到Lyn（MyrPalm-CFP）的肉豆蔻酰化和棕榈酰化序列。将YFP-PKC-YFP转移到含有MyrPalm-CFP的膜上会导致FRET增加。（B） 向HeLa细胞中添加10μM组胺会导致YFP-PKC-YFP快速振荡移位至质膜（黑色），对应于同一细胞（红色）中由呋喃红成像的振荡钙瞬变。数据代表了三个实验。
图6。
图6。
PLC PH域的移位δFRET报告显示，在钙振荡期间，PLC活性保持不变。（A） CYPHR是一种CFP-PHδ-YFP融合构建物，它通过分子间FRET在细胞膜移位时降低来报告PLC活性。结合PIP的PLCδ1的PH域2在质膜中，经PIP转运到胞浆2水解作用。从膜（二维）到胞浆（三维）的转运导致有效浓度降低，从而降低分子间FRET。（B） CYPHR报告钙振荡期间PLC活性恒定（黑色）（红色）。数据代表了四个实验。
图7。
图7。
PLC控制MDCK细胞中PKC活性的振荡。10μM ATP通过MyrPalm-CKAR（报告磷酸化）（A）、CYPHR（报告PLC活性）（B）和DAGR（报告DAG）（C）的反应诱导钙瞬变锁相。所有数据都代表了三到五个实验。
图8。
图8。
PKC信号的时间控制模型。非活性的细胞溶质PKC被假底物（1）自动抑制。磷脂酶激活导致DAG形成和钙释放：钙结合胞浆PKC（2），赋予弱的膜亲和力（3）。钙结合的PKC快速结合膜中的DAG，通过去除活性部位的假底物，产生最大的膜亲和力和完整的PKC活性（4）。钙或DG的下降会导致膜亲和力降低和假底物的再抑制（5）。PKC的这种巧合检测定义了细胞中的信号联系，磷酸化的严格时间保真度取决于第二信使和平衡磷酸酶活性的快速转换。
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