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.2003年5月15日；22(10):2411-21.
doi:10.1093/emboj/cdg231。

原文昌霉素TACE裂解调节GPCR诱导的癌细胞增殖和运动

安德烈亚斯·格什温 1, 斯特凡·哈特, 奥利弗·费舍尔, 阿克塞尔·乌尔里希
附属公司

原文昌霉素TACE裂解调节GPCR诱导的癌细胞增殖和运动

安德烈亚斯·格什温等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

G蛋白偶联受体（GPCR）和表皮生长因子受体（EGFR）信号系统之间的通信涉及EGF样前体的细胞表面蛋白水解。然而，EGFR信号反式激活途径的潜在机制在很大程度上尚不清楚。我们证明，在鳞状细胞癌细胞中，GPCR激动剂LPA或卡巴胆碱的刺激会导致金属蛋白酶的裂解和两性调节蛋白（AR）的释放。此外，通过siRNA沉默AR基因或通过中和抗体和肝素抑制AR生物活性可以阻止GPCR诱导的EGFR酪氨酸磷酸化、下游有丝分裂信号传导事件、细胞增殖、迁移和存活介质Akt/PKB的激活。因此，尽管EGF家族配体之间存在一些功能冗余，但本研究揭示了AR在GPCR触发的细胞反应中的独特而重要的作用。此外，我们提供的证据表明，金属蛋白酶组织抑制剂-3（一种显性阴性TACE突变或RNA干扰）阻断金属蛋白酶-双整合素肿瘤坏死因子-α转换酶（TACE）可抑制GPCR刺激的AR释放、EGFR激活和下游事件。因此，TACE可以作为GPCR介导信号的效应器发挥作用，并代表细胞受体串扰网络的关键元素。

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数字

无
图1。EGFR信号反式激活需要金属蛋白酶活性和EGFR的胞外结构域。SCC-9细胞预先用marimastat（BB2516，10µM；20 min）、抗EGFR抗体ICR-3R（20µg/ml；60 min）或PTX（100 ng/ml；18 h）培养，并用LPA（10µM）、卡巴胆碱（Car，1 mM）、EGF（7.5 ng/ml）或渗透酸盐（PV，1 M M）处理3 min。在用抗EGFR抗体对细胞提取物进行免疫沉淀（IP）后，用抗磷酸酪氨酸抗体对蛋白质进行免疫印迹（IB），并用抗EGFR-抗体对蛋白质重新进行保护。
无
图2。GPCR刺激导致金属蛋白酶依赖性的裂解和细胞表面AR的释放。(A类)流式细胞术分析EGF-like前体表达。收集SCC-9细胞，进行表面HB-EGF、TGF-α或AR染色，并进行流式细胞术分析。对照细胞仅用FITC-结合二级抗体标记。(B类)LPA诱导proAR蛋白水解过程。用batimastat（BB94；10µM）或PTX预培养SCC-9细胞，并用LPA或TPA（1µM。收集细胞并通过流式细胞仪分析细胞表面AR密度。(C类)GPCR诱导的AR蛋白水解释放。SCC-9细胞预先用batimastat或载体孵育，然后按指示用激动剂刺激120分钟。收集条件培养基并通过ELISA分析AR总量。每个bar是三个重复值的平均值（平均值±SD）*P（P）激动剂与BB94+激动剂之间的差异<0.03。
无
图3。前AR siRNA对GPCR诱导的EGFR激活和细胞迁移的影响。(A类)通过RNA干扰（RNAi）阻断EGF-like生长因子前体表达。用siRNA转染SCC-9细胞以检测proAR、proHB-EGF或proTGF-α，培养2天，并根据指示或(B类)用LPA或卡巴胆碱刺激并测定EGFR酪氨酸磷酸化含量。(C类)AR对LPA诱导的细胞迁移的要求。分析SiRNA转染的SCC-9细胞向纤连蛋白作为化学引诱剂的跨阱迁移。每个bar是四个重复值的平均值（平均值±SD）*P（P）对照siRNA+LPA与前AR siRNA+LPA的差异<0.001。
无
图4。抗AR中和抗体和肝素对AR生物活性的抑制可消除EGFR酪氨酸磷酸化、有丝分裂信号事件、Akt/PKB的激活和GPCR配体的细胞增殖。(A类)用抗AR抗体（αAR Ab；50µg/ml，60 min）或肝素（100 ng/ml，15 min）预处理SCC-9细胞，并刺激3 min（EGFR，上面板）或5 min（SHC，下面板），如图所示。沉淀的EGFR和SHC用抗磷酸酪氨酸抗体进行免疫印迹，然后分别用抗EGFR和抗SHC抗体复制相同的过滤器。(B类)Grb2与SHC的关联在体外SCC-9细胞预先与抑制剂孵育并刺激5分钟，如图所示。裂解物与GST–Grb-2融合蛋白或GST单独孵育。用单克隆抗SHC抗体免疫印迹蛋白质。(C类)AR是GPCR诱导的ERK/MAPK活化和Akt/PKB磷酸化所必需的。SCC-9或SCC-15细胞预先与抑制剂孵育并刺激7分钟。用抗磷酸-ERK抗体免疫印迹总裂解物检测磷酸化ERK1/2。用抗ERK抗体重新探测相同的过滤器。三个独立实验中ERK磷酸化的定量分析（平均值±标准偏差）*P（P）LPA与抑制剂+LPA之间的差异<0.05。刺激Akt/PKB。细胞裂解物用抗磷酸化Akt/PKB抗体进行免疫印迹，然后用抗Akt/PKB抗体复制相同的过滤器。(D类)PI3K和EGFR抑制对GPCR诱导的Akt/PKB磷酸化的影响。用沃特曼（WM，100 nM）、LY294002（100µM）、AG1478（250 nM）或载体预处理静止的SCC-9细胞30分钟，并用LPA或卡巴胆碱刺激15分钟。裂解后，用多克隆抗磷酸化Akt/PKB（P-Akt）抗体对总裂解物进行免疫印迹，然后用多克隆抗体对相同的过滤器进行复制，以检测活化的Akt/PKB。(电子)AR抑制对LPA诱导的DNA合成的影响。用所示抑制剂处理SCC-15细胞，并在有或无配体（LPA；AR，10 ng/ml）的情况下培养18 h。然后用脉冲标记细胞[三H] 用液体闪烁计数法测定胸苷和胸苷掺入量。三个独立实验的定量分析（平均值±标准偏差）*P（P）LPA与抑制剂+LPA的对比<0.001。
无
图5。TACE在HNSCC细胞系中的表达以及Timp-1和Timp-3表达对EGFR反式激活信号的影响。(A类)TACE是用单克隆TACE抗体从HNSCC细胞裂解液中免疫沉淀而成。转染人TACE cDNA的HEK-293细胞作为阳性对照。(B类)Timp-3，而不是Timp-1，抑制EGFR信号转录激活。SCC-9细胞被编码人类Timp-1或Timp-3的逆转录病毒感染。如图所示，用激动剂刺激后通过免疫印迹法测定EGFR的激活。(C类)携带C末端VSV标签的Timp-1和Timp-3的表达通过免疫印迹总细胞裂解物和抗VSV抗体确认。
无
图6。显性阴性TACE抑制GPCR诱导的AR释放和EGFR信号反式激活。(A类)逆转录病毒基因转移后SCC-9细胞中野生型（Wt 17）和显性阴性TACE（ΔMP 17）的表达。用多克隆抗TACE抗体对总裂解产物进行免疫印迹。(B类)显性-阴性TACE（ΔMP 17）消除LPA诱导的前AR裂解和(C类)分别通过流式细胞仪分析和AR ELISA测定AR释放到细胞培养基中。(D类)野生型（Wt 17）、显性负TACE（ΔMP 17）和显性负ADAM12（ΔMP12）对GPCR刺激的EGFR信号转录激活的影响。(电子)显性负性ADAM10（ΔMP 10）、ADAM12（ΔMP12）、ADAM 15（ΔMPa 15）和TACE（ΔMP 17）对GPCR刺激的EGFR信号反式激活的影响。(F类)逆转录病毒基因转移后SCC-9细胞中携带C末端HA标签的显性-阴性ADAM突变体的表达。用抗HA抗体对总裂解产物进行免疫印迹。
无
图7。TACE siRNA通过GPCR激动剂抑制EGFR信号传递和细胞迁移。(A类和B类)TACE siRNA阻断内源性TACE表达。用TACE或ADAM12 siRNA转染SCC-9细胞，用（A）RT-PCR或（B）多克隆抗TACE抗体免疫印迹分析基因表达。(C类)TACE的敲除导致proAR在细胞表面积聚。通过FACS分析siRNA-转染SCC-9细胞的AR细胞表面含量。(D类)GPCR激活时EGFR信号传输需要TACE。如图所示，用siRNA转染SCC-9细胞并用激动剂刺激。如上所述测定EGFR、SHC、ERK和Akt的激活。(电子)鳞癌细胞对LPA的反应依赖于TACE。用LPA或AR处理siRNA-转染的SCC-9细胞，并进行跨阱迁移分析。
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