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.2003年4月；23(8):2871-82.
doi:10.1128/MCB.23.871-2882.2003。

c-Jun NH（2）末端激酶对肿瘤坏死因子调节AP-1至关重要

胡安·何塞·文图拉 1, 诺曼·肯尼迪, 詹妮弗·A·兰姆, 理查德·弗拉维尔, 罗杰·戴维斯
附属公司

c-Jun NH（2）-末端激酶对肿瘤坏死因子调节AP-1至关重要

胡安·何塞·文图拉等。 分子细胞生物学. 2003年4月.

摘要

c-Jun NH（2）-末端激酶（JNK）被细胞因子肿瘤坏死因子（TNF）激活。该途径与TNF对AP-1依赖性基因表达的调节有关。为了研究JNK信号通路的作用，我们比较了TNF对野生型和Jnk1（-/-）Jnk2（-/--）小鼠胚胎成纤维细胞的影响。我们表明，TNF对AP-1的正常调节需要JNK。JNK缺陷细胞的c-Jun、JunD、c-Fos、Fra1和Fra2表达降低；c-Jun和JunD的磷酸化降低；并降低AP-1 DNA结合活性。JNK缺陷细胞在AP-1相关转录因子ATF2的调节方面也表现出缺陷。这些变化与TNF调节基因表达的显著缺陷有关。因此，JNK信号转导途径对TNF暴露细胞中AP-1转录因子的调节至关重要。

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数字

图1。
图1。
TNF对WT和WT中MAPK活化的影响Jnk公司−/−成纤维细胞。用免疫复合物蛋白激酶法（KA）检测TNF-α（10 ng/ml）处理不同时间的细胞中JNK（A）、p38 MAPK（B）和ERK（C）的活性。免疫印迹（IB）检测MAPK含量。激酶分析中的底物磷酸化使用磷成像仪进行定量，并以相对单位表示。所示数据来自单个实验，代表了三个独立的实验。
图2。
图2。
WT和WT中JNK表达和激活的比较Jnk公司−/−成纤维细胞。免疫荧光显微镜检查JNK和活化JNK（磷酸JNK）。在不使用（A）和（B）TNF-α（10 ng/ml，持续15分钟）的情况下处理细胞，将其固定，并用JNK抗体（FITC[绿色]）和磷酸化JNK（德克萨斯红[红色]）染色。DNA用DAPI（蓝色）染色。细胞通过常规荧光显微镜成像。
图3。
图3。
AP-1转录因子在WT和Jnk公司−/−成纤维细胞。WT和Jnk公司−/−细胞未经（−）和（+）TNF-α（10 ng/ml）处理。不同时间后采集细胞，分离总RNA。在核糖核酸酶保护试验中检测c-Jun、JunB、JunD、c-Fos、Fra1、Fra2和核糖体蛋白L32 mRNA。通过放射自显影法（A）检测mRNA，并通过PhosphorImager分析（B）定量。给出了标准化的AP-1 mRNA/L32 mRNA比率。所示数据代表了三个独立实验中获得的数据。
图4。
图4。
WT和WT中的AP-1转录因子Jnk公司−/−成纤维细胞。（A） WT和Jnk公司−/−分别用TNF-α（10 ng/ml）和TNF-β处理细胞。在不同的时间制备核提取物，并使用含有共识AP-1位点（TRE）和非敏感位点（Jun2 TRE）的探针，通过电泳迁移率变化分析检测DNA结合活性。通过放射自显影检测DNA结合活性（上图），并通过PhosphorImager分析定量（下图）。（B） WT和Jnk公司−/−分别用TNF-α（10 ng/ml）和TNF-β处理细胞。在不同时间后收集细胞。通过ATF2、c-Jun和JunD的抗体探测，通过免疫印迹分析检测细胞裂解物。使用磷酸特异性抗体检测JNK磷酸化位点上这些转录因子的磷酸化。用α-微管蛋白抗体对斑点进行检测，以监测凝胶每条通道上的蛋白质负荷。
图5：。
图5：。
JNK缺乏对ATF2磷酸化和亚细胞定位的影响。用免疫荧光显微镜检测ATF2和磷酸化-ATF2。成纤维细胞在不使用（A）和使用（B）TNF-α（10 ng/ml，持续15分钟）的情况下处理，固定，并用ATF2抗体（德克萨斯红[红]）和磷酸化-ATF2抗体（FITC[绿]）染色。DNA用DAPI（蓝色）染色。细胞通过常规荧光显微镜成像。
图6。
图6。
ATF2和c-Jun的磷酸化在Jnk公司−/−JNK1或JNK2异位表达后的成纤维细胞。（A） 补充分析Jnk公司−/−JNK1或JNK2的异位表达。Jnk公司−/−用表达WT JNK1或JNK2的逆转录病毒转导细胞。还使用表达激酶活性JNK1或JNK2（APF，用Ala-Pro-Phe替换三肽双磷酸化基序Thr-Pro-Tyr）的逆转录病毒进行了研究。WT单元，Jnk公司−/−细胞和四个补体Jnk公司−/−用TNF处理细胞群（15分钟）并收获以制备用JNK、ATF2、磷酸化-ATF2和磷酸化-c-Jun（B和c）WT细胞抗体进行检测的裂解物，Jnk公司−/−单元格，以及Jnk公司−/−补充有JNK1或JNK2的细胞在没有（−）和（+）TNF-α（10 ng/ml，持续60分钟）的情况下处理。分离总RNA（5μg），并使用RNase保护试验检测c-Jun、JunB和JunD（B）以及IL-6 mRNA（c）的表达。进行对照分析以测量核糖体蛋白L32的表达。
图7。
图7。
WT和WT中ATF2转录活性Jnk公司−/−成纤维细胞。使用融合到GAL4 DNA结合域的ATF2激活域在荧光素酶报告分析中检测ATF2活性（14）。研究了丙氨酸（GAL4/ATF2A）替代磷酸化激活位点（Thr-69和Thr-71）的效果。测量了萤火虫荧光素酶的相对活性，并将其归一化为检测到的共转染对照的活性量雷尼利亚荧光素酶报告质粒。（A） 检测了MEK激酶1（MEKK1）、MKK6（Ser208Glu/Thr-211Glu）和混合利尿激酶3（MLK3）共表达的影响。（B） 补充分析Jnk公司−/−JNK1或JNK2的异位表达。细胞与JNK1或JNK2表达载体共转染。通过共转染空表达质粒进行对照研究。
图8。
图8。
JNK在TNF刺激的细胞因子表达中的作用。（A） WT和Jnk公司−/−成纤维细胞饥饿3h，然后用TNF-α（10 ng/ml）处理。纯化总RNA，并用5μg进行RNase保护试验，以测量TNF-α、IL-6、IFN-γ、LIF、GM-CSF、M-CSF和核糖体蛋白L32 mRNA的量。所示数据代表了三个独立的实验。（B） RNase保护试验用于测量WT和WT表达的TNF-α、IL-6和IFN-γmRNA的量Mkk公司−/−细胞。
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工具书类

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