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.2003年3月4日；100(5):2730-5.
doi:10.1073/pnas.0538015100。 Epub 2003年2月26日。

富含甘油三酯的脂蛋白的脂解产生PPAR配体：脂蛋白脂肪酶抗炎作用的证据

欧利亚娜·齐乌岑科娃 1, 斯蒂芬·佩里, Liana Asatryan公司, 朱莉安娜·黄, 凯伦·麦克诺尔, 大卫·E·莫勒, 丹尼尔·雷德, 亚历克斯·塞瓦尼安, 鲁道夫·泽切纳, 杰拉尔德·霍夫勒, 豪尔赫·普卢茨基
附属公司

富含甘油三酯的脂蛋白的脂解产生PPAR配体：脂蛋白脂肪酶抗炎作用的证据

欧利亚娜·齐乌岑科娃等。 美国国家科学院程序. .

摘要

富含甘油三酯的脂蛋白水平的增加会刺激动脉壁中的脂质积聚，从而触发以动脉粥样硬化为中心的早期炎症反应，如内皮粘附分子的表达。限制此类反应的内源性机制仍不明确。脂蛋白脂肪酶（LPL）通过水解富含甘油三酯的脂蛋白和释放脂肪酸，在脂质代谢中发挥着重要作用。我们发现，LPL治疗逆转了肿瘤坏死因子α和极低密度脂蛋白（VLDL）刺激的内皮血管细胞粘附分子1（VCAM1）诱导和VCAM1启动子反应，从而重述了合成过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）激动剂的作用。事实上，在从PPARα缺陷小鼠分离的内皮细胞中，这些LPL对VCAM1的作用是不存在的。这一发现表明LPL具有新的抗炎作用。进一步的研究揭示了脂蛋白底物（VLDL>>LDL>HDL）、PPAR亚型（PPARα>>PPARδ>PPARγ）以及脂肪酸释放脂肪酶之间通过脂解激活PPAR的特异性。这些PPAR反应需要完整的LPL催化活性。在体内，过表达LPL的转基因小鼠增加了过氧化物酶体增殖，但在PPARα基因缺失的情况下没有。尽管人血浆中含有丰富的游离脂肪酸，但其PPARα活性最低，但在体外添加LPL或体内系统释放LPL后，人血浆中可观察到明显的PPARα活化。这些数据表明，关键脂解酶LPL可以作用于循环脂蛋白以生成PPARα配体，从而在脂蛋白代谢和远端PPARα转录效应之间提供潜在的重要联系。

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数字

图1
图1
LPL抑制VLDL/TNFα介导的VCAM1表达和启动子活性。(A类)PPARα激动剂WY14643（WY，250μM）处理的人EC中VCAM1 mRNA表达的Northern分析；VLDL（5μg），含或不含LPL（200单位/ml，4小时）；在有或无TNFα刺激（50 ng/ml，17 h）的情况下饱和FA（16:0）。仅LPL没有影响（数据未显示）。(B类)在存在（实线）或不存在（虚线）LPL的情况下，在VLDL浓度范围内测试TNFα介导的VCAM1启动子（6）激活。所有转染实验均在牛主动脉EC（DMEM，1%Nutridoma SP）中进行。EC用含或不含LPL的VLDL预处理（200单位/ml，4 h），然后用TNFα刺激（2 ng/ml，12 h）。荧光素酶结果归一化为β-半乳糖苷酶活性。相比之下，250μM WY14643将TNFα诱导的VCAM1启动子的激活抑制了2.6倍。n个=3份，每份一式三份。
图2
图2
LPL/VLDL通过PPARα依赖机制抑制VCAM1水平。(A类)从WT（填充棒）或PPARα获得的EC中VCAM1表面表达−/−（开放栏）小鼠采用ELISA测定，如所述（6）。在96个平板中培养的EC如图1所示进行处理A类小鼠TNFα（10 ng/ml，18 h）。数据表示蛋白质浓度标准化后在410nm处的吸光度。在WT中，但不在PPARα中−/−，EC WY14643和LPL/VLDL均显著降低VCAM1水平（*，P（P）< 0.005). PPARα中的基本VCAM1水平−/−与WT EC相比显著增加（#，P（P）< 0.001). (B类)在有或无LPL（30单位/ml）的情况下，各种脂蛋白对PPARα-LBD的浓度依赖性激活。EC与PPARα-LBD共转染，荧光素酶反应pUASx4-TK-luc和β-半乳糖苷酶结构被刺激，如图所示（18 h，DMEM，1%脱脂血清）。在本实验中，非诺比利亚酸（100μM）对PPARα-LBD的激活是16.2-±1.3倍。
图3
图3
脂解导致PPARα活化的方式对PPAR亚型、脂肪酶和底物具有选择性。(A类)如图2所示，使用标准pUASx4-TK-luc报告子结构和β-半乳糖苷酶标准化方法，在存在或不存在LPL的情况下，测量EC中VLDL对PPAR-LBD的激活B类在存在或不存在VLDL（10μg/ml）的情况下，用LPL（14小时，30单位/ml）刺激细胞。对已建立的PPAR激动剂的反应用于比较：PPARγ−BRL49653（BRL，1μM）；PPARα−WY14643（WY，100μM）；PPARδ−碳前列环素（碳，10μM）。(B类)通过将LPL/VLDL反应混合物与特定放射性标记的PPAR活化剂孵育，生成竞争曲线：5 nM三H（H）2含有GST-hPPARα（圆圈）或GST-hPCARγ（三角形）的化合物A，或2.5 nM三H（H）2化合物B与GST-hPPARδ（平方）。绘制了VLDL（0.003–10μg/ml蛋白质）/LPL（200单位/ml LPL，37°C，1 h）指示浓度下的放射性配体位移。数据来自重复测定。K（K）我S值从剂量-反应曲线中获得。(C类)PPARα的激活是通过LPL介导的脂解而非其他一些FA释放脂肪酶介导的。EC，如图2所示转染B类用显示的脂蛋白（10μg/ml蛋白质）和LPL（20单位/ml）或磷脂酶PLA处理（18小时2（20单位/ml）、PLD（20单位/毫升）或PLC（2单位/毫升。显示了控件（开放条）、VLDL（填充条）、LDL（水平条纹条）和HDL（对角条纹条）。(天)图3中生成的FAC类如图所示。用分光光度法测量培养基中的FA含量，如方法标准偏差5%；图3中指定的钢筋C类.分光光度测定与棕榈酸标准以浓度依赖的方式相关（数据未显示）。
图4
图4
LPL/VLDL对PPARα的活化依赖于完整的LPL催化活性。(A类)采用VLDL（10μg/ml）与不同形式的LPL（重组LPL（30单位/ml）或热失活LPL（Inact.LPL））相结合，在EC中研究LPL催化活性对PPARα-LBD活化的作用；人LPL（Over-expr.LPL）或催化失活突变LPL的转染表达构建物。结果以标准LPL/VLDL响应的百分比表示。星号表示PPARα-LBD激活显著减少(P（P）<0.01，Mann–Whitney检验）与适当的对照组进行比较。在添加LPL/VLDL之前，EC过度表达LDL受体（LDLR/LPL）或用细胞松弛素D（10μM）、肝素（100μg/ml）或肝素酶（200单位/ml）预处理1h，没有发现差异。(B类)EC标记的VLDL摄取。用VLDL（对照）和DiI-标记的VLDL（5μg/ml蛋白质）刺激细胞，无论是否有LPL（30单位/ml，18小时）。显示了典型福尔马林固定样品的荧光显微镜（×20倍放大）。DiI VLDL显示为红色，DNA显示为蓝色。(C类)在添加LPL（30单位/ml）/VLDL（10μg/ml）之前，将LPL与脂肪酶抑制剂四氢叶酸抑制素在所示浓度下预培养（室温下15分钟）。PPARα-LBD激活显著抑制(P（P）<0.01，Mann–Whitney检验）与对照组的比较结果如图所示（*）。
图5
图5
酶完整LPL诱导PPARα靶基因mRNA表达。(A类 左侧)用空载体（PcDNA3）、人WT LPL或无催化活性的LPL（突变LPL）转染HepG2细胞（24 h，DMEM，1%脱脂血清），并用RT-PCR确认表达水平（数据未显示）。Northern分析显示，VLDL处理（5μg/ml，3 h）可诱导LPL处理细胞中ACO mRNA的表达，但如果用四氢脂蛋白抑制素（THL，10μM）预处理（15 min），则不会。表达突变LPL的HepG2细胞在VLDL处理后没有ACO诱导。(赖特)与之前一样，在转染和刺激的HEK293细胞中也观察到类似的Northern结果。(B类)用LPL孵育HepG2细胞（200单位/ml，1h），检测ACO mRNA表达对VLDL的浓度反应。(C类)如图5所示，LPL/VLDL处理诱导人Mφ中ACO和LPL mRNA的表达B类。显示了三个代表性结果中的一个。(天)体内WT-LPL过度表达/PPARα对骨骼肌的分析+/+和LPL过度表达/PPARα−/−在PPARα存在但不存在的情况下，小鼠的过氧化物酶体增殖增加，LPL过度表达。禁食小鼠（12周龄，n个=3）使用PMP70抗体进行分析。
图6
图6
LPL介导的PPARα激活是富含甘油三酯的脂蛋白代谢的一种独特成分。(A类)PPARα-LBD反式激活分析如图2所示B类通过使用在基线（−LPL）时从6名正常高脂血症献血者获得的人血浆样本（5%），在添加LPL后在体外（200单位/ml，37°C，1小时）至肝素前血浆，或在全身肝素输注（60单位/kg）后体内.符号代表个人捐赠者；线表示平均值。本实验中10μM WY14643的相对PPARα-LBD折叠激活为20.3±0.3；FA浓度分别为1.7±0.8μM（−LPL）、18.2±9.3μM（+LPL）和18.2±6.8μM（肝素后）。(B类)TRL的代谢通过非酶和酶机制进行。尽管这些途径最终导致FA的产生及其各种下游效应，但通过脂肪分解激活PPARα似乎在一定程度上限制了LPL。所提供的数据表明，内源性脂解的特定机制可以通过配体生成导致特定的转录反应。因此，LPL介导的PPARα激活可能在循环中富含甘油三酯的脂蛋白和远端PPARα效应（如抗炎反应、FA氧化和脂质代谢）之间提供联系。后者可能包括通过PPARα的可能正反馈回路，通过诱导LPL和抑制ApoCIII导致LPL表达和活性增加。
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