blue cheese mutations define a novel, conserved gene involved in progressive neural degeneration

doi:10.1523/JNEUROSCI.23-04-01254.2003

.2003年2月15日；23(4):1254-64.

doi:10.1523/JNEUROSCI.23-04-01254.2003。

蓝奶酪突变定义了一个参与进行性神经变性的新的保守基因

金·D·芬利¹, 菲利普·伊登, 罗伯特·C·卡明, 米歇尔·德·马尔达尔·杜梅斯尼, 芭芭拉·泰勒, 玛丽亚·罗德里格斯, 卡尔文·E·黄, 迈克尔·贝内德蒂, 迈克尔·麦考恩

附属公司

PMID： 12598614
PMCID公司：项目经理1975817
内政部： 10.1523/JNEUROSCI.23-04-01254.2003

蓝奶酪突变定义了一个参与进行性神经变性的新的保守基因

金·D·芬利等。神经科学. 2003.

.2003年2月15日；23(4):1254-64.

doi:10.1523/JNEUROSCI.23-04-01254.2003。

作者

附属

¹美国加利福尼亚州拉霍亚市索尔克生物研究所分子与细胞生物学实验室和细胞神经生物学实验室，邮编：92037-1099。finley@salk.edu

PMID： 12598614
PMCID公司：项目经理1975817
内政部： 10.1523/JNEUROSCI.23-04-01254.2003

摘要

许多人类神经退行性疾病的一个共同特征是在中枢神经系统中积聚不溶性泛素蛋白聚集体。尽管果蝇有助于理解几种人类神经退行性疾病，但尚未发现导致不溶性中枢神经系统蛋白聚集体的功能丧失突变。对果蝇突变的研究可以确定与人类退行性疾病相关的独特成分。果蝇蓝奶酪（bchs）基因定义了这种新的退化途径。bchs突变体的成年寿命缩短，在整个CNS神经膜中形成与年龄相关的蛋白质聚集体。这些包涵体含有不溶性泛素化蛋白和淀粉样前体样蛋白。在老年bchs突变体中，CNS的大小和形态逐渐丧失，同时出现广泛的神经元凋亡。BCHS蛋白广泛表达于中枢神经系统神经元的细胞质中，并存在于轴突投射的整个长度上。BCHS的大小接近3500个氨基酸，最后1000个氨基酸由三个功能蛋白基序组成，涉及囊泡运输和蛋白质加工。该区域以及之前在人类、小鼠和线虫基因组中编码的未经鉴定的蛋白质，在BCHS蛋白全长上显示出惊人的同源性。果蝇和人类bchs之间的高度保守性表明，对bchs功能途径和相关突变表型的研究可能为人类神经退行性疾病提供有用的见解。

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数字

**图1。**
这个*十亿立方英尺*区域、突变、蛋白质结构和物种比对。A类、发现删除的位置和范围*十亿立方英尺*如图所示。地图*十亿立方米*基因组区域和缺失边界如前所述[Finley等人（1998）；见材料和方法中的flybase网站]。The location and arrangement of the十亿立方英尺和*dsf公司*基因和402Cy P-元素也被指示(w个⁺;*黑暗的*灰色)和P元素生成*十亿立方英尺*突变(*十亿立方英尺*^三和*十亿立方英尺⁴*;*浅灰色*). 402Cy P元素是Df（2L）dsf3和Df（2 L）dsf 4删除的父元素*十亿立方米^三*插入。它携带在CyO染色体上，作为老化实验中的野生型对照。B类，的内含子/外显子结构*十亿立方英尺*通过cDNA和基因组序列的比较和比对确定。指出了BEACH、WD40和FYVE蛋白基序的位置以及潜在的磷酸化位点。显示了P元素插入的位置。The extent of the十亿立方英尺⁵内部缺失（由DNA测序确定）由*阴影条*.一种精确的切除衍生物*十亿立方英尺^版本1*等位基因，由DNA测序确定，由*箭头所示。C类*,*果蝇属*通过比较推断的氨基酸序列生成脊椎动物和线虫BCHS蛋白比对。不同BCHS蛋白的总大小、蛋白结构域和氨基酸序列是保守的，包括可能识别该区域内功能基序的前2500个氨基酸。C末端区域内已识别的结构域在不同的门上具有最高的氨基酸同源性，在蛋白质的延伸区域上达到>80%。

**图2。**
过早死亡*十亿立方英尺*突变体。在实验期间，收集新绝育的雄性大鼠，并在29°C下老化。A类，不精确的切除*十亿立方英尺*⁴P元素，在*十亿立方英尺*基因，导致平均寿命缩短，如*十亿立方英尺⁵*/*十亿立方英尺⁵*,*十亿立方英尺⁶*/*十亿立方英尺⁶*,*十亿立方米⁷*/*十亿立方英尺⁷*,*十亿立方英尺⁸*/*十亿立方英尺⁸*、和*十亿立方英尺⁹*/*十亿立方英尺⁹*飞行线路。抢救早死发生在同样的情况下*十亿立方英尺⁴*P元件从其*十亿立方英尺*位置，如*十亿立方英尺^版本1*/*十亿立方英尺^版本1*行。B类，的第一个内含子中的P元素插入*十亿立方英尺*减少平均寿命，如*十亿立方英尺^三*/Df（2L）凝块7，*十亿立方英尺⁴*/*十亿立方英尺⁴*、和*十亿立方英尺⁴*/Df（2L）凝块7基因组合。C类，含有一个或多个野生型拷贝的苍蝇*十亿立方米*,*广州S*、402Cy/Df（2L）w3或402Cy/Df（2 L）凝块7的平均寿命在29.0到32.5天之间*十亿立方英尺*基因组区域去除后，与对照组相比，Df（2L）dsf3/Df。变异*dsf公司*基因在案件中*dsf公司¹*/Df（2L）凝块苍蝇不会显著改变成虫的平均寿命。平均寿命、标准偏差和第页表1总结了基因型选择值。

**图3。**
BCHS mRNA和蛋白表达模式。A类，Northern blot分析20个成年雄性和雌性头部的总RNA。野生型(1)和*dsf公司*¹/Df（2L）凝块7(三)突变体大脑表达一个约12.0 kb的mRNA，这是Df（2L）dsf3/Df（2 L）凝块苍蝇所没有的(2).B类，野生型法拉特成虫的冰冻切片（Finley等人，1998年）用于就地杂交到*十亿立方英尺*mRNA。特定标签*十亿立方英尺*在水平部分通过天线瓣水平的头部检测到。标记出现在含有神经元细胞体的皮层区域，在神经膜区域不存在。箭头指向标记的皮层细胞；显示了天线叶（AL）、视叶（OL）和视网膜（R）。在头部肌肉或其他组织中未检测到mRNA。成人胸部切片也显示一致*十亿立方英尺*在胸腹神经节神经元中进行标记，而在其他组织中不进行标记（数据未显示）。C类BCHS的Western blot分析显示，在1日龄小鼠头部提取物中，一种蛋白质的分子量远远高于最大分子量标记（250 kDa）*广州S*(1)和402CyO/Df（2L）凝块7(2)野生型控件。在这个年龄*十亿立方米⁴*/Df（2L）凝块苍蝇(三)表达一些BCHS，而BCHS在*十亿立方英尺^三*/Df（2L）凝块7(4)和Df（2L）dsf3/Df（2 L）凝块7(5)苍蝇。2周时只有野生型苍蝇(1)具有可检测的BCHS蛋白水平。蛋白质不再被检测到*十亿立方英尺⁴*/Df（2L）凝块苍蝇(三).D–F型，BCHS蛋白的亚细胞定位。D类，三龄幼虫眼盘双标BCHS免疫荧光染色（基底切片；*FITC公司*)和神经特异性标记ELAV（心尖切片；*德克萨斯州红*). 这两种蛋白在神经元中表现出相似的时间表达模式，但ELAV主要位于细胞核内，而BCHS位于细胞质中(中心;*合并的面板*).E类，眼盘(*预计起飞时间*)，光轴(*操作系统*)和附着的幼虫视叶(*OL公司*)为BCHS（FITC）染色。该蛋白沿光感受器轴突的整个长度分布。这个插入是一张增强的强度图像，显示BCHS延伸至生长锥。这种模式之所以可见，是因为在此发育时间点周围未分化成神经细胞中缺乏BCHS表达。F类，视网膜中成熟的BCHS表达模式(*R（右）*)和板神经节(*LG公司*)2周龄婴儿的光学部分*dsf公司¹*/Df（2L）血栓7成人(n个= 9). 老年人的BCHS蛋白水平仍然很高（与Western blots一致）。该蛋白仍位于视网膜轴突和板神经节的细胞质中。*G公司*，来自年龄匹配的相同视网膜和附加CNS的增强图像*十亿立方英尺*突变型[Df（2L）dsf3/Df（2 L）clot7；n个= 11]. 这种染色水平与仅二级抗体相似，并且大大低于*十亿立方米*⁺动物。

**图4。**
神经变性和凋亡*十亿立方英尺*突变体。*A–F*，用亚甲基蓝染色的成人视网膜的塑料包埋切向切片（1μm）。早期小眼形态的微小差异归因于每一节的深度和特定眼睛内的位置。A类，视网膜形态*广州S*1日龄的对照组与*十亿立方米*^三/Df（2L）凝块7(B类)同龄个体。C类，在10 d时，野生型对照组显示出成熟的结构和细胞形态*果蝇属*视网膜，而年龄匹配*十亿立方英尺^三*/Df（2L）凝块苍蝇(D类)显示退化的最初迹象（液泡箭头).E类14天大时，野生型视网膜看起来健康完整，只有罕见的小液泡发育(箭头).F类，14天时，早期检测到的退化*十亿立方英尺^三*/Df（2L）clot7突变体果蝇取得了进一步进展。小脑结构大量丧失，空泡扩大(箭头).G、 H（H），如食道所示，在头部同一深度、靠近中央复合体的10天龄成年人的额叶切片（1μm）(E类,箭头)和扇形(*FB公司*)和椭球体(*电子束*).G公司，一个取自10-d旧控件的部分显示了成熟控件的特征组织和大小*果蝇属*神经结构。*H（H）*，来自的Age-matched部分*十亿立方英尺^三*/Df（2L）血栓苍蝇显示视网膜变性(箭头)以及椎板萎缩(*LG公司*)和骨髓(*MG公司*)中脑下外侧神经节(*ILD公司*)，上外侧(*SLPr公司*)和内侧(*SMPr公司*)原大脑和食管下神经节(*SOG公司*)中枢神经系统的结构。由于轻微的图像增强，此图像中的核心和背景显得更暗。*一、 J型*,现场2周龄大脑的TUNEL分析。在野生型大脑中(我)的箭头指示经历凋亡的细胞的有限数量[402CyO/Df（2L）clot7；n个= 10].十亿立方英尺没有大脑(J型)具有广泛的TUNEL标记，表明中枢神经系统大多数皮层区域有大量细胞发生凋亡[Df（2L）dsf3/Df（2 L）blot7；n个= 7].

**图5。**
中枢神经系统蛋白质聚集物的形成。*A–G*，取成人CNS至少5μm的0.2μm横向光学切片。A类，一个11天大的野生型成人大脑的光学切片(n个=27）肌动蛋白（阳萎素-TRITC，德克萨斯红）和泛素染色(*FITC公司*). 正常的苍蝇在中枢神经系统中具有一致的肌动蛋白和泛素蛋白模式。肌动蛋白富含神经投射和突触神经支配区域，而泛素在整个中枢神经系统中均匀染色。B类，年龄匹配*十亿立方英尺*没有大脑(n个=53）在中枢神经系统中有泛素沉积，主要在神经膜区域。C类，10 d旧野生型控件的共焦图像(n个=20）硫黄素S染色(绿色)和抗泛素(*特克斯R*).D类，来自年龄匹配的相同图像*十亿立方英尺*^三/Df（2L）凝块苍蝇(n个=15）用硫黄素S染色，并检测泛素聚集物。E类，来自11天大的Df（2L）dsf3/Df（2 L）凝块7成人大脑的共焦切片(n个=22）APPL染色(*特克斯R*)和泛素(*FITC公司*).果蝇属APPL与中枢神经系统中的泛素沉积共定位。F类，在2周龄的野生型对照中不会形成APPL聚集物(n个= 12).G公司,插入扩大（通过蘑菇体的部分）表明泛素和APPL在蛋白质聚集体中密切相关。

**图6。**
成人泛素结合蛋白的免疫印迹分析*果蝇属*头部。（1）野生型（2）头部序列蛋白提取物*十亿立方英尺*⁴/Df（2L）凝块7，（3）*十亿立方英尺^三*/用Western blot分析法检测Df（2L）blot7和（4）Df（2 L）dsf3/Df（2-L）clot7苍蝇的游离泛素和蛋白质结合形式。A类在Triton X-100组分（易溶蛋白）中，游离泛素和高分子量泛素结合蛋白的水平在检测的任何基因型或年龄段（1或14天）均未发生显著变化。在更严格的提取（SDS分数）后，幼年动物中也未检测到可溶性较低的泛素结合蛋白的显著差异。B类，在第14天，所有三种SDS组分中可溶性较低的高分子量泛素化共轭物的数量都显著增加*十亿立方英尺*突变组合，但不适用于野生型对照。这个*十亿立方英尺⁴*与野生型对照组相比，等位基因（2）增加了近九倍，而Df（2L）dsf3/Df（2 L）clot7缺失基因型（4）积累水平最高（增加了22.8倍）。结果总结见表1。

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