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.2003年2月4日；100(3):904-9.
doi:10.1073/pnas.252770599。 Epub 2003年1月21日。

耶尔森菌YopT蛋白酶的生化特性：Rho-GTPases中的裂解位点和识别元件

冯绍 1, Panayiotis O Vacratsis公司, 赵勤宝, 凯瑟琳·鲍尔斯, 卡罗尔·菲尔克, 杰克·E·狄克逊
附属公司

耶尔森菌YopT蛋白酶的生化特性：Rho-GTPases中的裂解位点和识别元件

冯绍等人。 美国国家科学院程序. .

摘要

革兰氏阴性细菌病原耶尔森菌向宿主细胞传递六种效应蛋白，以阻止宿主固有免疫反应。其中一种效应物YopT会破坏肌动蛋白细胞骨架，并有助于抑制病原体的吞噬作用。YopT作为半胱氨酸蛋白酶来裂解Rho家族GTPases。我们用TLC分析了Rho GTPases的YopT裂解产物，并用MS测定了其化学结构。通过氨基酸标记实验确定了RhoA中YopT分解发生的确切位置。我们的数据明确证明，YopT将RhoA、Rac和Cdc42中的N-末端裂解为戊基半胱氨酸，并且GTPases的裂解产物是香叶基香叶基半胱胱氨酸甲酯。YopT同样切割GTP-和GDP结合形式的RhoA，这表明切割不取决于GTP-酶的构象状态。YopT也能裂解RhoA的法尼基和香叶基香叶酰化形式。RhoA C末端的多基序列对YopT底物识别和裂解至关重要。

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数字

图1
图1
YopT裂解产物的薄层色谱鉴别。(A类)脂质裂解产物的薄层色谱分离。[三H] 甲羟戊酸标记的RhoAL63（通道1和2）、Rac1L61（通道3和4）和Cdc42L61（路径5和6）与野生型（通道1、3和5）或YopT C139S突变蛋白（通道2、4和6）孵育在体外每个裂解反应的氯仿提取物在TLC板上斑点。通过TLC平板放射自显影术观察脂质分解产物。GGCM是指三H标记的合成GGCM标准（车道7）。(B类)Rho家族GTPases RhoA、Rac1和Cdc42的C末端序列。
图2
图2
RhoA中YopT裂解位点的测定。(A类)异戊二烯化的[35S] 赛斯，但不是[14C] YopT将RhoA中的Gly（戊烯基半胱氨酸的N末端）裂解。(上部)氯仿萃取RhoA的YopT裂解产物的闪烁计数[14C] Gly或[35S] Cys标记。(下部)放射自显影法测定放射性标记RhoA水平(左侧)Western blot检测RhoA总蛋白(赖特)存在于每个裂解反应中。(B类)RhoA脂质YopT裂解产物的纳米电喷雾MS/MS分析。所示为GGCM标准的碎片模式(底部)对于单个带电的母离子(米/z（z）408.7）与YopT裂解反应后的RhoA样品(中间). (顶部)GGCM标准的化学结构。突出显示的碎片对应于标准物和RhoA裂解产物的MS/MS光谱中观察到的碎片离子。
图3
图3
YopT分裂了GDP和GTP结合形式的Rho GTPases。(A类)体外用RhoAL63和RhoAN19进行YopT切割试验。GST标记的RhoA变体从标记有[三H] 甲羟戊酸并与YopT孵育。裂解产物用SDS/PAGE分离并用放射自显影分析。通过损失三RhoA中的H-香叶基香叶酰基(上部). 通过抗RhoA蛋白印迹分析测定RhoA总蛋白(下部). (B类)体外用RhoA-GTP[γS]和RhoA-GDP[βS]进行YopT切割试验。野生型GST-RhoA从标记有[三H] 甲羟戊酸盐并负载GTP[γS]或GDP[βS]在体外并用于文中所述的YopT裂解分析。
图4
图4
RhoA中的C末端多基序列对YopT识别和切割至关重要。(A类)YopT对多碱基RhoA突变体的裂解体内(左侧)和在体外(赖特). RhoA[K（R）5Q]代表在C末端有五个碱基残基（两个精氨酸和三个赖氨酸）被谷氨酰胺取代的多碱基RhoA突变体。按照文中所述进行裂解分析。(B类)多碱基RhoA突变体的GST下拉试验。GST RhoA变体与Flag标记的YopT C139S在HEK293T细胞中共表达，并通过GST亲和层析纯化。谷胱甘肽珠和相关YopT上的GST-RhoA量由抗GST测定(下部)和反旗帜(上部)蛋白质印迹。RhoAΔCaaX是指RhoA的CaaX缺失突变体，用作阴性对照。(C类)用嵌合GST融合蛋白进行YopT切割试验。GST-CLVL和GST-ARRGKKKSGCLVL对应于由RhoA-CaaX盒（CLVL）或RhoA C末端的最后13个残基和N末端GST标记组成的融合蛋白。GST-H-Ras（1–166）-ARGKKKSGCLVL是一种嵌合结构，通过将H-Ras中的羧基23残基序列替换为RhoA C末端的13残基序列而生成。这些GST融合蛋白在标记有[三H] 甲羟戊酸盐。产生的戊二醛化GST融合蛋白与三H-香叶基香叶酰基标记后按照文中所述进行YopT裂解试验。
图5
图5
戊二酸半胱氨酸甲酯在YopT识别中的作用。(A类)用法尼基RhoA进行YopT裂解试验。进行了切割试验体内通过在标记有[三H] 甲羟戊酸盐。解理是通过三RhoA中的H-香叶基香叶酰基(上部). 抗RhoA蛋白印迹检测RhoA的表达(下部). (B类)用香叶基香叶酰化重组RhoA进行YopT切割试验在体外（无aaX蛋白水解和甲基化）。重组GST-RhoA经香叶基香叶基修饰在体外使用香叶基香叶基转移酶和三H-香叶基香叶基焦磷酸如文中所述。将产生的标记GST-RhoA（RhoA-CLVL）固定在谷胱甘肽小球上并与重组YopT孵育。用HEK293T细胞产生的完全修饰的GST-RhoA作为阳性对照（RhoA-CoMe）。(C类)体内用共表达的YopT和RhoA V192Y进行YopT裂解分析，RhoA是一种RhoA突变体，可阻断aaX蛋白水解以及随后的香叶基香叶酰化半胱氨酸甲基化。(天)RhoA V192Y突变株的GST下拉试验。实验按文中所述进行。通过GST下拉框的反Flag Western blot评估突变RhoA和YopT C139S之间的结合亲和力。
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