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.2003年1月20日；197(2):263-8.
doi:10.1084/jem.20021790。

通过交替剪接的短形式MyD88抑制白细胞介素1受体/Toll样受体信号传导是由于其未能招募IRAK-4

金伯利·伯恩斯 1, 索菲·詹森, 布莱恩·布里索尼, 纳塔莉亚·奥利沃斯, 鲁迪·贝亚特, 朱尔格·切普（Jürg Tschopp）
附属机构

通过交替剪接的短形式MyD88抑制白细胞介素1受体/Toll样受体信号传导是由于其未能招募IRAK-4

金伯利·伯恩斯等。 实验医学杂志. .

摘要

Toll样受体（TLR）和促炎性白细胞介素1受体（IL-1R）家族成员依赖MyD88的存在进行有效的信号转导。MyD88（N末端死亡域[DD]和COOH末端Toll/IL-1受体[TIR]域）的双重性质使其能够将IL-1R/TLR的TIR域与称为IL-1R-相关激酶（IRAK）-1的Ser/Thr激酶的DD连接起来。这会触发IRAK-1磷酸化，进而激活多种信号级联，例如激活转录因子核因子（NF）-κB。相反，MyD88短片段（MyD88s）的表达是MyD88的一种选择性剪接形式，它只缺少分离DD和TIR结构域的短中间结构域，导致IL-1/脂多糖诱导的NF-kappaB活化被关闭。在这里，我们提供了这种差异的分子解释。MyD88而非MyD88与IRAK-4强烈相互作用，IRAK-4是一种新发现的对IL-1R/TLR信号至关重要的激酶。在MyD88存在的情况下，IRAK-1不被磷酸化，也不激活NF-kappaB，也不被泛素化。因此，MyD88充当IL-1R/TLR/MyD88触发信号的负调节器，导致先天性免疫反应的转录控制负调节。

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数字

图1。
图1。
MyD88的ID对IRAK-1磷酸化至关重要。（A） 我的D88−/−-用空载体MyD88或MyD88s表达载体通过逆转录病毒感染重建缺陷MEF细胞系。重组细胞群被称为MEF+向量，MEF+MyD88和MEF+用10 ng/ml IL-1β刺激MyD88和MyD88 0.5或16 h。制备总细胞裂解物，并用抗IRAK-1抗体通过Western blotting监测IRAK-1水平。MEF中MyD88或MyD88的水平+MyD88和MEF+用抗MyD88抗体（中间）对MyD88细胞进行Western分析。负载控制显示抗IRAK抗体检测到一条非特异性带。（B） MEF公司+向量，MEF+MyD88和MEF+用IL-1β或TNFα刺激MyD88s细胞达到指定时间。MyD88的重组−/−-MyD88而非MyD88s的缺陷型MEFs恢复NF-κB信号传导，IκB降解证明了这一点，用抗IκB抗体的Western分析监测了这一点。在两个MEF中+向量和MEF+用TNFα治疗证明，IκB降解机制MyD88s细胞完好无损。
图2。
图2。
IRAK-4诱导的IRAK-1磷酸化由MyD88/MyD88s调节。（A） 将IRAK-1KD（IRAK-1D340N）与指定表达载体共转染293T细胞。制备总细胞裂解物，用10%SDS-PAGE分离，并用抗IRAK-1抗体进行Western blotting分析。IRAK-4、MyD88和/或MyD88s的表达通过适当抗体的Western分析得到确认。（B） IRAK-1KD从与指示蛋白共存的细胞提取物中免疫沉淀，然后进行体外激酶分析。然后在SDS-PAGE和放射自显影后检测IRAK-1KD的磷酸化（上图）。所示蛋白（底部面板）的表达水平，如顶部面板通道1-5中转染的一样，通过适当抗体的Western blotting进行确认。（C） 使用293T细胞裂解液中的抗Flag抗体与指定的表达质粒组合共转染，并用抗IRAK-1抗体进行免疫印迹，共免疫沉淀IRAK-4（顶部）。在中间和底部，显示了使用抗-IRAK-1、抗Flag和抗E抗体分别检测IRAK-1KD、IRAK-4和MyD88/MyD88s的细胞裂解物的Western blotting。免疫沉淀；WB、Western blot。
图3。
图3。
MyD88不与IRAK-4结合，并阻止其向IL-1受体招募。（A） 顶部面板的左侧显示，IRAK-4是使用来自转染有所示表达质粒的293T细胞裂解液的抗VSV抗体进行免疫共沉淀的，并使用抗Flag抗体进行免疫标记。中间和底部面板分别显示使用抗VSV或抗MyD88抗体的免疫沉淀物和细胞裂解物的Western印迹。顶部面板的侧面显示，MyD88是使用与所示表达质粒共转染的293T细胞裂解液中的抗E抗体进行免疫共沉淀，并用抗IRAK-1抗体进行免疫印迹。中间和底部面板显示使用抗E（中间）或抗IRAK-1（底部）抗体的免疫沉淀物或细胞裂解物的蛋白质印迹。免疫沉淀；WB、Western blot。（B） HF7c酵母与编码pGBT9 GAL4 DNA结合域的表达载体共转化，该结合域融合到各种MyD88缺失突变体（示意图所示）和表达GAL4转录激活域的pGAD10 IRAK-4融合到全长IRAK-4。通过β半乳糖苷酶表达过滤试验评估蛋白质的相互作用表示检测后60分钟内出现强烈的颜色变化，−表示在24小时内没有出现颜色变化。所有pGBT9融合蛋白均被检查为自动激活，结果为阴性。（C） 用与所示表达质粒共转染的293T细胞裂解液中的抗Flag抗体对标记的IL-1R进行共免疫沉淀，并用抗Xpress抗体进行免疫印迹，以检测IRAK-4KD的相关性。用抗Flag、抗E和抗IRAK-1抗体重复相同的印迹，分别监测IL-1Rs、MyD88和IRAK-1KD水平。底部面板显示使用所示抗体的细胞裂解物的Western印迹。
图4。
图4。
IRAK-4诱导的IRAK-1磷酸化的MyD88/MyD88s调节模型。在左边，MyD88将IRAK-1与IRAK-4连接起来——激活NF-κB。IL-1刺激IL-1R可诱导含有MyD88、IRAK-1和IRAK-4的信号复合物的组装。MyD88的二聚体结合IRAK-1和IRAK-4，使各自的激酶结构域紧密结合（步骤1）。这导致IRAK-4磷酸化IRAK-1，进而可能诱导IRAK-1的激酶活性，导致其自身磷酸化（步骤2）。IRAK-4在IL-1R处被激活，但尚未得到正式证明。磷酸化IRAK-1首先结合TNFR-相关因子6（未描述）激活NF-κB，然后泛素化（多个箭头连接到IRAK-1）并降解。为简单起见，省略了其他适配器分子，如Tollip（12）。右侧显示了MyD88对IL-1信号的抑制作用。MyD88（描述为缺少ID的较短分子）不与IRAK-4相互作用。IRAK-4不被招募到IL-1R中，从而阻止了IRAK-1和IRAK-4的结合，从而阻止IRAK-1的磷酸化。因此，没有NF-κB激活。
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