An attenuating mutation in nsP1 of the Sindbis-group virus S.A.AR86 accelerates nonstructural protein processing and up-regulates viral 26S RNA synthesis

doi:10.1128/jvi.77.2.1149-1156.2003

.2003年1月；77(2):1149-56.

doi:10.1128/jvi.77.2.1149-1156.2003。

Sindbis-group病毒S.A.AR86 nsP1的减弱突变加速非结构蛋白处理并上调病毒26S RNA合成

马克·T·海斯¹, 劳拉·怀特, 丹尼斯·A·辛普森, 克里斯托弗·伦纳德, 克里斯汀·伯纳德, 里克·B·米克尔, 罗伯特·约翰斯顿

附属公司

PMID： 12502831
预防性维修识别码：项目经理140780
内政部： 10.1128/jvi.77.2.1149-1156.2003年

Sindbis-group病毒S.A.AR86 nsP1的减弱突变加速非结构蛋白处理并上调病毒26S RNA合成

马克·T·海斯等。 J维罗尔. 2003年1月.

.2003年1月；77(2):1149-56.

doi:10.1128/jvi.77.2.1149-1156.2003。

作者

马克·T·海斯¹, 劳拉·怀特, 丹尼斯·辛普森, 克里斯托弗·伦纳德, 克里斯汀·伯纳德, 里克·B·米克尔, 罗伯特·约翰斯顿

附属

¹美国北卡罗来纳大学教堂山分校微生物与免疫学系，27599。heisem@med.unc.edu

PMID： 12502831
预防性维修识别码：项目经理140780
内政部： 10.1128/jvi.77.2.1149-1156.2003年

摘要

Sindbis群α病毒S.A.AR86在非结构蛋白1（nsP1）538编码一种苏氨酸，该蛋白与成年小鼠的神经毒力有关。在非神经毒性Sindbis群α病毒中发现的nsP1 538 Thr到共有Ile的突变减弱了成年小鼠神经毒性的S.A.AR86，而在非神经毒性Sindbis病毒背景中538位引入Thr赋予了增加的神经毒性（M.T.Heise等人，J.Virol.74:4207-4213000）。由于病毒非结构区的变化可能会影响病毒复制，因此进行了研究，以评估nsP1 538的Thr或Ile对病毒生长、非结构蛋白加工和RNA合成的影响。Neuro2A和BHK-21细胞的多步生长曲线表明，减毒s51（nsP1 538 Ile）病毒与野生型s55（nsP1538 Thr）病毒相比具有轻微但可复制的生长优势。nsP1 538位于nsP1和nsP2之间的裂解识别域中，nsP1 53 8处的Ile减弱加速了S.A.AR86非结构蛋白在体外和感染细胞中的加工。由于已知非结构蛋白加工可以调节α病毒RNA的合成，因此进行了实验以评估nsP1538的Ile或Thr对病毒RNA合成的影响。S.A.AR86衍生报告子分析和RNase保护分析的组合确定，在nsP1 538中存在Ile导致病毒26S启动子的早期表达，而不影响病毒的负或正品牌合成。这些结果表明，野生型S.A.AR86感染中较慢的非结构蛋白处理和延迟的26S RNA合成可能与S.A.AR85的成年小鼠神经毒力表型有关。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
在多步体外生长曲线中，减毒突变体s51（nsP1 538 Ile）的生长水平高于野生型s55（nsP1538 Thr）病毒。以MOI为0.01的s55（实心正方形）或s51（实心圆形）感染Neuro2A（A）或BHK-21（B）细胞。在指定的时间点取出上清液样本，并通过菌斑试验评估病毒产量。所示数据来自三个代表性实验之一。每个点代表三个独立井的平均滴度，具有标准偏差。

**图2。**
通过减毒s51病毒在感染细胞中加速非结构蛋白处理。用野生型s55（实心方块）病毒（nsP1 538 Thr）或减毒的s51（实心圆）病毒（nsP1 538Ile）以5.0的MOI感染BHK-21细胞2小时。然后用[³⁵S] 蛋氨酸15分钟，然后用过量的冷蛋氨酸追逐10、20或30分钟，在这一点上产生细胞裂解物。（A）从细胞裂解液中免疫沉淀NsP1，并在10%聚丙烯酰胺凝胶上通过SDS-PAGE进行分析。正常兔血清作为非特异性抗体相互作用的对照。（B） A组s55或s51感染细胞nsP1相对水平图。所示为四个代表性实验之一的结果。

**图3。**
nsP1 538处的Ile减弱加速了体外非结构蛋白的加工。（A）将s55（实心方块）或s51（实心圆圈）的全长RNA转录物在体外翻译为[³⁵S] 用兔网织红细胞裂解物测定蛋氨酸。翻译反应在30°C下培养40分钟。此时，添加过量的未标记的蛋氨酸和环己酰亚胺以停止翻译，反应转移到37°C。停止翻译并升高温度后，在0、20、40、60和80 min时取出样品，通过SDS-PAGE进行分析。（B）在荧光成像仪上分析了s55或s51翻译反应中P123和P12裂解中间体以及成熟nsP1和nsP2的水平随时间的变化。数据表示每个时间点相关频带的像素总数。所示数据来自面板A中所示的凝胶。（C）弱毒TR339（nsP1 538 Ile）和神经毒力39ns1（nsP1538 Thr）的全长RNA转录物如图2A所示进行翻译。所示为三个代表性实验之一的结果。

**图4。**
nsP1 538处的Ile减弱增加了S.A.AR86 26S启动子的表达。用S.A.AR86衍生的具有野生型Thr（REP89-GFP）或突变体Ile（REP91-GFP）的复制子颗粒在nsP1 538以0.1的MOI感染BHK-21细胞。这些复制子表达来自病毒26S启动子的GFP，该启动子被用作26S表达的替代标记。在感染后4小时，收集细胞并通过流式细胞术分析GFP表达（荧光[Fl]）。所示为BHK-21细胞的三个实验之一的代表性直方图。

**图5：。**
Ile的衰减导致更快地诱导26S RNA合成，但不影响负或正品牌合成。BHK-21细胞以5.0的MOI感染野生型s55或突变型s51病毒。在感染后3或6小时收集总细胞RNA，并使用探针保护病毒+和26S RNA、病毒负链RNA或小鼠β-肌动蛋白片段，通过RNase保护分析进行分析。代表性RNase保护试验显示s55或s51感染细胞的3小时和6小时时间点。每个泳道代表来自独立样本的RNA。在3小时的时间点，每个样品使用5微克的总细胞RNA，在6小时的时间点将每个样品使用1微克。由于与负链水平相比，β-肌动蛋白信号过多，因此负链和β-肌动蛋白带的强度不同。

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