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.2002年12月23日；159(6):931-8.
doi:10.1083/jcb.200209124。 Epub 2002年12月23日。

凋亡过程中Bax与线粒体裂变位点、Drp1和Mfn2的时空关联

马吕斯·卡博夫斯基 1, 杨家利, 布里吉特·高梅, Seon Yong Jeong先生, 斯蒂芬·弗兰克, 阿莫茨·内丘什坦, 安斯加·桑特尔, 玛格丽特·富勒, 卡罗琳·史密斯, 理查德·J·尤尔
附属公司

凋亡过程中Bax与线粒体裂变位点、Drp1和Mfn2的时空关联

马吕斯·卡博夫斯基等。 J细胞生物学. .

摘要

我们发现，Bax是Bcl-2家族的促凋亡成员，在凋亡的初始阶段易位到线粒体上的离散病灶，随后成为线粒体断裂位点。Drp1的显性阴性突变体Drp1K38A抑制线粒体的凋亡性断裂，但不抑制Bax移位或合并成病灶。然而，Drp1K38A导致与Bax簇相关的线粒体裂变中间产物的积累。令人惊讶的是，Drp1和Mfn2，而不是其他与线粒体形态调控有关的蛋白质，在这些病灶中与Bax共定位。我们认为Bax参与线粒体的凋亡断裂。

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数字

图1。
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凋亡Cos-7细胞线粒体上Bax簇的定位。（A） 用1μM STS处理转染有mito-DsRed2（绿色）的细胞6 h，固定，用抗Bax 6A7单克隆抗体（红色）染色，共聚焦显微镜分析。（B） 细胞与CFP-Bax和mito-YFP共转染。转染后12小时，用1μM STS处理细胞90分钟，并通过共聚焦显微镜检查。每个区域显示了凋亡的Cos-7细胞中线粒体（绿色）和Bax灶（红色）的典型形态之一。Bax与线粒体收缩位点（箭头）或管状细长线粒体的尖端和线粒体的位置有关。（C和D）Cos-7细胞经1μM STS处理后，分别用抗Bax 6A7单克隆抗体和抗GFP单克隆抗体染色内源性Bax（C）或CFP-Bax（D），然后进行电镜分析，免疫金标记的银增强处理。在死亡细胞中，内源性Bax定位于线粒体尖端和收缩位点。棒材，0.5μm。
图2。
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凋亡Bax簇与线粒体断裂位点共定位。用CFP-Bax和mito-YFP共转染HeLa（A和B）和Cos-7（C）细胞。转染后12 h，用1μM STS处理细胞，并通过共焦显微镜随时间进行分析。线粒体的碎片化和囊泡化开始于Bax（红色）在线粒体断裂部位（箭头）结合的同时（在A中为75到80分钟）。破碎的线粒体通常通过含Bax的结构（A和B）保持连接。还检测到碎片线粒体完全分离（C）。
图3。
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图纸1K38A公司导致Bax相关裂变中间产物的积累。（A） WT Drp1和Drp1的引入K38A公司霸王龙-Drp1、霸王龙-Drp1K38A公司和T-Rex-V细胞用1μg/ml四环素处理24 h，并分析WT Drp1、Drp1的表达K38A公司通过Western Blotting。（B） 霸王龙-Drp1，霸王龙-Drp1K38A公司用1μg/ml四环素处理T-Rex-V细胞24 h，然后用1μM STS处理5 h，并用Western Blotting分析Bax向细胞膜的移位。（C） 生存力T-Rex-Drp1、T-Rex-Drp1K38A公司，并按照材料和方法中的描述对T-Rex-V进行分析。数据表示两个实验的平均值±SD，每个场的起始细胞数为100个。在每个时间点对每个样本的两个字段进行计数。（D） 用pcDNA 3.1-Drp1和pcDNA 3.1-Bax或pcDNA3.1-Drp1共同转染Cos-7细胞K38A公司和pcDNA 3.1-Bax（比率3:1），用1μM STS处理2 h，细胞分馏后，用Western Blotting分析重膜组分和胞浆。（E和F）细胞转染CFP-Bax、YFP-20和pcDNA3.1-Drp1（E）或CFP-Bax、YFP-20和pcDNA1-Drp1K38A公司（F） （比例2:0.5:6），用1μM STS处理90分钟，并用共焦显微镜进行分析。箭头表示OMM内陷；可能代表以CFP-Bax团簇定位的裂变中间产物。棒材，20μm。（G） 高倍放大来自F的一些线粒体（G1和G2，对照；G3-6，STS处理细胞）。箭头显示Bax团的位置，可能代表早期裂变位置。（H和I）用CFP-Bax和pcDNA3.1-Drp1（H）或CFP-Bax和pcDNA3.1-Drp1转染细胞K38A公司（I） ，用1μM STS处理90分钟，并通过电子显微镜分析Bax簇的线粒体下定位。I1中的箭头指向与Bax簇相关的膜泡化。I3中的箭头指向与Bax簇相关的收缩位点。棒材：（H，I1，I3嵌件，I4，I5）0.2微米，（I2）0.1微米，（I3）1微米。
图3。
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图纸1K38A公司导致Bax相关裂变中间产物的积累。（A） WT Drp1和Drp1的引入K38A公司.霸王龙-Drp1，霸王龙-Drp1K38A公司和T-Rex-V细胞用1μg/ml四环素处理24 h，并分析WT Drp1、Drp1的表达K38A公司通过Western Blotting。（B） 霸王龙-Drp1，霸王龙-Drp1K38A公司用1μg/ml四环素处理T-Rex-V细胞24 h，然后用1μM STS处理5 h，并用Western Blotting分析Bax向细胞膜的移位。（C） 生存力T-Rex-Drp1、T-Rex-Drp1K38A公司，并按照材料和方法中的描述对T-Rex-V进行分析。数据表示两个实验的平均值±SD，每个场的起始细胞数为100个。在每个时间点对每个样本的两个字段进行计数。（D） 用pcDNA 3.1-Drp1和pcDNA 3.1-Bax或pcDNA3.1-Drp1共同转染Cos-7细胞K38A公司和pcDNA 3.1-Bax（比率3:1），用1μM STS处理2 h，细胞分馏后，用Western Blotting分析重膜组分和胞浆。（E和F）细胞转染CFP-Bax、YFP-20和pcDNA3.1-Drp1（E）或CFP-Bax、YFP-20和pcDNA1-Drp1K38A公司（F） （比例2:0.5:6），用1μM STS处理90分钟，并用共焦显微镜进行分析。箭头表示OMM内陷；可能代表以CFP-Bax团簇定位的裂变中间产物。棒材，20μm。（G） 高倍放大来自F的一些线粒体（G1和G2，对照；G3-6，STS处理细胞）。箭头显示Bax团的位置，可能代表早期裂变位置。（H和I）细胞转染CFP-Bax和pcDNA3.1-Drp1（H）或CFP-Bax和pcDNA1-Drp1K38A公司（一） 用1μM STS处理90分钟，并通过电子显微镜分析Bax团簇的亚线粒体定位。I1中的箭头指向与Bax簇相关的膜泡化。I3中的箭头指向与Bax簇相关的收缩位点。棒材：（H，I1，I3嵌件，I4，I5）0.2微米，（I2）0.1微米，（I3）1微米。
图3。
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图纸1K38A公司导致Bax相关裂变中间产物的积累。（A） WT Drp1和Drp1的引入K38A公司.霸王龙-Drp1，霸王龙-Drp1K38A公司，和T-Rex-V细胞用1μg/ml四环素处理24小时，并分析WT Drp1、Drp1的表达K38A公司通过Western Blotting。（B） 霸王龙-Drp1，霸王龙-Drp1K38A公司用1μg/ml四环素处理T-Rex-V细胞24 h，然后用1μM STS处理5 h，并用Western Blotting分析Bax向细胞膜的移位。（C） 生存力T-Rex-Drp1、T-Rex-Drp1K38A公司，并按照材料和方法中的描述对T-Rex-V进行分析。数据表示两个实验的平均值±SD，每个场的起始细胞数为100个。在每个时间点对每个样本的两个字段进行计数。（D） 用pcDNA 3.1-Drp1和pcDNA 3.1-Bax或pcDNA3.1-Drp1共同转染Cos-7细胞K38A公司和pcDNA 3.1-Bax（比例3:1），用1μM STS处理2小时，细胞分级后，通过Western印迹分析重膜组分和细胞溶质。（E和F）细胞转染CFP-Bax、YFP-20和pcDNA3.1-Drp1（E）或CFP-Bax、YFP-20和pcDNA1-Drp1K38A公司（F） （比例2:0.5:6），用1μM STS处理90分钟，并用共焦显微镜进行分析。箭头表示OMM内陷；可能代表以CFP-Bax团簇定位的裂变中间产物。棒材，20μm。（G） 高倍放大来自F的一些线粒体（G1和G2，对照；G3-6，STS处理细胞）。箭头显示Bax团的位置，可能代表早期裂变位置。（H和I）细胞转染CFP-Bax和pcDNA3.1-Drp1（H）或CFP-Bax和pcDNA1-Drp1K38A公司（一） 用1μM STS处理90分钟，并通过电子显微镜分析Bax团簇的亚线粒体定位。I1中的箭头指向与Bax簇相关的膜泡化。I3中的箭头指向与Bax簇相关的收缩位点。棒材：（H，I1，I3嵌件，I4，I5）0.2微米，（I2）0.1微米，（I3）1微米。
图3。
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图纸1K38A公司导致Bax相关裂变中间产物的积累。（A） WT Drp1和Drp1的引入K38A公司霸王龙-Drp1、霸王龙-Drp1K38A公司和T-Rex-V细胞用1μg/ml四环素处理24 h，并分析WT Drp1、Drp1的表达K38A公司通过Western Blotting。（B） 霸王龙-Drp1，霸王龙-Drp1K38A公司用1μg/ml四环素处理T-Rex-V细胞24 h，然后用1μM STS处理5 h，并用Western Blotting分析Bax向细胞膜的移位。（C） 生存力T-Rex-Drp1、T-Rex-Drp1K38A公司，并按照材料和方法中的描述对T-Rex-V进行分析。数据表示两个实验的平均值±SD，每个场的起始细胞数为100个。在每个时间点对每个样本的两个字段进行计数。（D） 用pcDNA 3.1-Drp1和pcDNA 3.1-Bax或pcDNA3.1-Drp1共同转染Cos-7细胞K38A公司和pcDNA 3.1-Bax（比例3:1），用1μM STS处理2小时，细胞分级后，通过Western印迹分析重膜组分和细胞溶质。（E和F）用CFP-Bax、YFP-20和pcDNA3.1-Drp1转染细胞（E），或用CFP-Bax、YFP-20和pcDNA3.1-Drp1转染细胞K38A公司（F） （比例2:0.5:6），用1μM STS处理90分钟，并用共焦显微镜进行分析。箭头表示OMM内陷；可能代表以CFP-Bax团簇定位的裂变中间产物。棒材，20μm。（G） 高倍放大来自F的一些线粒体（G1和G2，对照；G3-6，STS处理细胞）。箭头显示Bax团的位置，可能代表早期裂变位置。（H和I）细胞转染CFP-Bax和pcDNA3.1-Drp1（H）或CFP-Bax和pcDNA1-Drp1K38A公司（一） 用1μM STS处理90分钟，并通过电子显微镜分析Bax团簇的亚线粒体定位。I1中的箭头指向与Bax簇相关的膜囊泡。I3中的箭头指向与Bax簇相关的收缩位点。棒材：（H，I1，I3嵌件，I4，I5）0.2微米，（I2）0.1微米，（I3）1微米。
图4。
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Mfn2蛋白形成线粒体相关的点状病灶，在凋亡期间与Bax共定位。将Cos-7细胞与CFP-Bax（蓝色）和Mfn2-YFP（绿色）共转染，在没有（A）和（B）1μM STS的情况下培养90min，然后用Mitotracker CMXRos（红色）染色后用共焦显微镜进行分析。在未经处理的细胞（A）中，Bax主要是胞质的，Mfn2集中在点状线粒体病灶中。在凋亡细胞（B）中，Bax定位于含有Mfn2的病灶。线扫描绘制CFP-Bax（蓝色）和Mfn2-YFP（绿色）的强度。棒材，20μm。
图5。
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诱导凋亡后，Bax定位于含有Drp1的线粒体病灶。用CFP-Bax（蓝色）、YFP-Drp1（绿色）和mito-DsRed2（红色）三重转染HeLa（A）和Cos-7（B）细胞。在转染后12 h，用1μM STS处理细胞以诱导凋亡，并通过共焦显微镜随时间进行分析。在Bax易位/聚集（A，顶部）之前（−STS）和之后（+STS）分析细胞的相同区域。A中的底部面板显示了CFP-Bax和YFP-Drp1本地化的独立示例。线扫描绘制CFP-Bax（蓝色）和YFP-Drp1（绿色）的强度。在凋亡细胞中，线粒体病灶处Bax与Drp1的染色明显。（B） CFP-Bax（蓝色）和YFP-Drp1（绿色）在健康（−STS）和凋亡Cos-7细胞（+STS）中的定位。线粒体基质用mito-DsRed2标记（红色）。CFP-Bax和YFP-Drp1在线粒体的簇中共定位（覆盖层中为青色）。（C） 凋亡细胞中内源性Bax和Drp1的克隆化。在zVAD-fmk存在下，用1μM STS处理Cos-7细胞6小时。细胞用抗Bax 6A7单克隆抗体（红色）和抗Drp1多克隆抗体（绿色）染色。箭头指向内源性Bax和Drp1共同定位的一些病灶。箭头显示了一些Drp1病灶，它们与Bax不共定位，可能代表Drp1的非线粒体亚群（Yoon等人，1998）。棒材，20μm。
图5。
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诱导凋亡后，Bax定位于含有Drp1的线粒体病灶。用CFP-Bax（蓝色）、YFP-Drp1（绿色）和mito-DsRed2（红色）三重转染HeLa（A）和Cos-7（B）细胞。在转染后12 h，用1μM STS处理细胞以诱导凋亡，并通过共焦显微镜随时间进行分析。在Bax易位/聚集（A，顶部）之前（−STS）和之后（+STS）分析细胞的相同区域。A中的底部显示了CFP-Bax和YFP-Drp1定位的独立示例。线扫描绘制CFP-Bax（蓝色）和YFP-Drp1（绿色）的强度。在凋亡细胞中，线粒体病灶处Bax与Drp1的染色明显。（B） CFP-Bax（蓝色）和YFP-Drp1（绿色）在健康（−STS）和凋亡Cos-7细胞（+STS）中的定位。线粒体基质用mito-DsRed2标记（红色）。CFP-Bax和YFP-Drp1在线粒体的簇中共定位（覆盖层中为青色）。（C） 凋亡细胞中内源性Bax和Drp1的克隆化。在zVAD-fmk存在下，用1μM STS处理Cos-7细胞6小时。细胞用抗Bax 6A7单克隆抗体（红色）和抗Drp1多克隆抗体（绿色）染色。箭头指向内源性Bax和Drp1共存的一些病灶。箭头显示了一些Drp1病灶，它们与Bax不同处，可能代表Drp1的非线粒体亚群（Yoon等人，1998年）。棒材，20μm。
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