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.2002年11月；161(5):1849-59.
doi:10.1016/S0002-9440（10）64461-6。

吞噬细胞产生C5a

马库斯·休伯·朗 1, 艾伦·M·杨金, J维迪亚·萨尔马, 尼尔斯·里德曼, 斯蒂芬妮·麦奎尔, 克里斯蒂娜·T·卢, 罗宾·昆克尔, 约翰·杨格, Firas S Zetoune公司, 彼得·A·沃德
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吞噬细胞产生C5a

马库斯·胡贝尔·朗等。 美国病理学杂志. 2002年11月.

摘要

补体激活产物C5a是一种强大的炎症因子。使用抗体检测人或大鼠C5a，在pH 7.4的条件下，将人血中性粒细胞或大鼠肺泡巨噬细胞（AM）与C5在佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐（PMA）的存在下孵育，导致C5a的产生。用脂多糖激活的大鼠AM也从C5中生成C5a。中性粒细胞活化后，C5发生广泛裂解，而活化的巨噬细胞对C5具有更高的选择性蛋白水解活性。当用佛波酯刺激时，外周血人或大鼠单核细胞和大鼠肺泡上皮细胞都没有表现出裂解C5的能力，这表明吞噬细胞裂解C5具有特异性。对于大鼠AMs，C5a生成是时间依赖性的，如果AMs用转录或蛋白质合成抑制剂（放线菌素D或放线菌酮）预处理，C5a的生成就会被阻断。添加C5后，对活化的人类多形核白细胞的类似处理仅部分减少C5a的生成。活化AMs产生的C5a具有生物（化学）活性。这一代对丝氨酸蛋白酶抑制剂敏感，但对其他种类的抑制剂不敏感。这些数据表明吞噬细胞，特别是肺巨噬细胞，可以从C5中生成C5a。就肺部而言，这可能是一条重要的C5a生成途径，它独立于血浆补体系统。

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数字

图1。
图1。
通过激活的人类PMN、人类PBMC或大鼠AM生成C5a。电池（1×107)在pH 7.4下与90μg人C5和（如有指示）PMA（100 ng/ml）或LPS（0.5μg/ml）在37°C下孵育4小时，然后用抗人C5a进行Western blot分析。分子量标记的位置显示在最末端左边数据代表三个或更多独立的实验。
图2。
图2。
在37°C下与90μg C5孵育4小时后，PMA不能刺激大鼠AECs产生C5a。使用抗人C5a进行Western blot分析的条件与图1所示的条件相似▶ . 数据代表三个或更多独立实验。
图3。
图3。
活化的人类PMN或大鼠AM在类似于图1所述条件下水解C5的能力▶ 除抗人C5抗体用于免疫印迹外。数据代表了两个独立的实验。
图4。
图4。
A类和B类：将90μg人C5添加到10×10后4小时获得的上清液中人C5a的Western blot检测6AMs公司(A类)或10×106项目管理编号(B)在PMA（100 ng/ml）存在下。分子量标记的位置显示在极端右车道.抄送：在C5含量增加（30至120μg）的情况下，对PMA刺激的大鼠AM上清液进行Western blot分析。蛋白质印迹A类,B、和C类均用抗人C5a进行了检测。数据代表四个或更多独立实验。
图5。
图5。
答：使用抗人C5a对各种样品进行Western blot分析。分子量标记位于车道1和重组人C5a车道2PMA、大鼠AM和C5组合上清液中的C5裂解产物如所示车道3活化人血清中的C5a(车道4)首先用抗人C5a免疫沉淀，然后用Western blot分析。B类：AM-生成C5a的Western blot分析。分子量标准(车道5)；来自未刺激的（10mmol/L EDTA）大鼠AM的上清液，其中添加了C5(车道6)以及在不含EDTA的情况下，来自类似处理的大鼠AM的上清液(车道7).中间框架(车道8)：使用抗人C5a抗体作为免疫检测抗体，但预先吸收重组人C5a（10μg/ml），然后用于检测如所示的相同产品车道7.右侧框架：含有凝胶的银渍9号车道材料类似于车道6，而10号车道所含材料与车道7参考分子量标准见11号车道数据代表两个独立的实验。
图6。
图6。
使用插入对于这些研究，107将大鼠AMs与90μg人C5a在37°C下孵育4小时。详见正文。fMLP的浓度为100 nmol/L。与C5存在下PMA刺激AM的上清液进行统计比较(黑色条标签为“无”）。在进行趋化分析之前，将针对大鼠C5a或人类C5a的IgG抗体（10μg/ml）添加到上清液中。数据代表了三个独立的实验。
图7。
图7。
答：使用抗人C5a抗体进行Western blot分析：车道1，分子量标准；车道2，重组人C5a（100 ng）；车道3，PMA刺激大鼠AM的上清液，向其添加C5（90μg），并在37°C下孵育4小时；车道4，类似于车道3但在孵育开始时添加SBTI（100μg/ml）除外。B类：使用相同抗人C5a抗体的Western blot：车道5，人类C5a；车道6到9，PMA刺激AM的上清液，其中添加了C5（90μg），存在0至100μg SLPI/ml。数据代表两个独立的实验。
图8。
图8。
活化AM和PMN在放线菌素D和环己酰亚胺存在下使用类似于图1所述条件生成C5a的能力▶ . 文本中提供了详细信息。用抗人C5a抗体检测蛋白质印迹。数据代表两个独立的实验。
图9。
图9。
表中所示样品中人类PMN的趋化活性左上插图大多数细节与图6图例中描述的内容类似▶ . 在某些情况下，在添加PMA和C5之前，将SBTI（100μg/ml）或SLPI（100μg/ml）添加到大鼠AM悬浮液中。中性粒细胞对重组人C5a（0.01至1000 nmol/L）的趋化反应的剂量反应如右上插图数据代表三个独立的实验。
图10。
图10。
大鼠溶血活性（CH50）(A类)或人类(B)在各种血清稀释液中加入固定浓度的SBTI（100μg/ml）或SLPI（100μg/ml）。虚线显示50%溶血值。数据代表两个独立的实验。
图11。
图11。
肺泡腔局部生成C5a的建议模型。来自血管室的C5或由各种类型的肺细胞局部产生的C5被激活的肺巨噬细胞裂解，生成具有生物活性的C5a。巨噬细胞的裂解酶似乎是一种可诱导的丝氨酸蛋白酶，可被自然产生的SLPI阻断。C5裂解后，C5a导致中性粒细胞迁移到肺泡腔，导致炎症介质、氧化产物和其他破坏性蛋白酶的释放。C5a也可能以自分泌方式刺激肺巨噬细胞以增强炎症反应。
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