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.2002年10月15日；21(20):5396-407.
doi:10.1093/emboj/cdf551。

AGC激酶和PDK1中的磷酸丝氨酸/苏氨酸结合囊通过疏水基序磷酸化介导活化

莫滕·弗罗丁 1, 托本·L·安塔尔, 贝蒂娜·阿杜姆勒, 克劳斯·杰森, 玛丽亚·迪克, Steen Gammeloft公司, 里卡多·M·比昂迪
附属公司

AGC激酶和PDK1中的磷酸丝氨酸/苏氨酸结合囊通过疏水基序磷酸化介导活化

莫滕·弗罗丁等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

生长因子激活的AGC蛋白激酶RSK、S6K、PKB、MSK和SGK通过激活环和疏水基序（激酶结构域的C端）中的丝氨酸/苏氨酸磷酸化激活。在其中一些激酶中，疏水基序的磷酸化创建了一个特定的对接位点，该位点招募并激活PDK1，PDK1随后磷酸化激活环。在这里，我们发现PDK1激酶结构域中有一个口袋，通过识别两个位置相反的精氨酸和赖氨酸残基来识别疏水基序中的磷酸丝氨酸/磷酸苏氨酸。此外，我们证明RSK2、S6K1、PKBalpha、MSK1和SGK1包含类似的磷酸盐结合囊，它们用于与自身磷酸化疏水基序的分子内相互作用。分子模型和实验数据为磷酸化疏水基序和活化环作用于激酶结构的αC螺旋以诱导协同刺激催化活性的共同活化机制提供了证据。序列保守性表明，这一机制是激活40多种人类AGC激酶的关键特征。

PubMed免责声明

数字

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图1。PKA和主要生长因子激活的AGC激酶的结构比对。该比对表明，生长因子激活的AGC激酶具有两个调节特征：激活环（点状区域）的磷酸化和位于激酶结构域尾部区域（红框）C末端的疏水基序（蓝框）的磷酸化合。请注意，PRK2含有磷酸化天冬氨酸残基，PKA在疏水基序中缺乏磷酸化位点。
无
图2。PDK1与RSK2磷酸化疏水基序之间的对接相互作用模型。(一个)PDK1疏水口袋的静电表面电位模型，蓝色为正电位，红色为负电位。RSK2疏水基序肽（FRGFpSFV）显示为白色，Ser386上的磷酸基显示为黄色。(B类)带文本中讨论的残留物侧链的口袋的带状表示。PDK1残基为红色、蓝色或灰色，而RSK2疏水基序肽显示为绿色，磷酸基显示为黄色。
无
图3。PDK1中与磷酸化疏水基序相互作用所需的精氨酸/赖氨酸残基的鉴定。(一个)将表达野生型或突变型myc-PDK1的质粒与HA-RSK2、GST-PRK2或空载体（Vec）共同转染COS7细胞。在48小时和最后3小时的血清饥饿期后，对表达RSK的细胞进行35分钟EGF处理，然后对细胞进行裂解。分别使用抗HA抗体或谷胱甘肽珠从细胞裂解液中沉淀HA-RSK2和GST-PRK2。沉淀物经过SDS-PAGE和抗myc抗体免疫印迹检测共沉淀物myc-PDK1（上面板）或抗-HA免疫染色或蛋白质染色，以评估HA-RSK2和GST-PRK2的数量（下面板）。对沉淀前裂解物进行myc标记免疫印迹（中间板）。(B类)在BiaCore3000系统中，使用表面等离子体共振测量分析了PDK1与RSK2疏水基序的相互作用。磷酸化基序的生物素化肽（pHMRSK公司)或非磷酸化（HMRSK公司)使用Ser386对传感器芯片SA进行涂层（10个响应单元）。（1） 将不同浓度（0.013–3.33µM）的GST–PDK1注射到pHM涂层芯片上。在插图中，根据PDK1的不同浓度绘制了稳态结合曲线。使用Kaleidabrograph软件将数据拟合为双曲线，从而获得动力学常数。（2和3）将GST–PDK1野生型、–R131A或–R131M以400 nM注入涂有pHM的芯片RSK公司和HMRSK公司分别是。（A）和（B）中的所有实验进行了三次，结果相似。
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图3。PDK1中与磷酸化疏水基序相互作用所需的精氨酸/赖氨酸残基的鉴定。(一个)将表达野生型或突变型myc-PDK1的质粒与HA-RSK2、GST-PRK2或空载体（Vec）共同转染COS7细胞。在48小时和最后3小时的血清饥饿期后，对表达RSK的细胞进行35分钟EGF处理，然后对细胞进行裂解。分别使用抗HA抗体或谷胱甘肽珠从细胞裂解液中沉淀HA-RSK2和GST-PRK2。沉淀物经过SDS-PAGE和抗myc抗体免疫印迹检测共沉淀物myc-PDK1（上面板）或抗-HA免疫染色或蛋白质染色，以评估HA-RSK2和GST-PRK2的数量（下面板）。对沉淀前裂解物进行myc标记免疫印迹（中间板）。(B类)在BiaCore3000系统中，使用表面等离子体共振测量分析了PDK1与RSK2疏水基序的相互作用。磷酸化基序的生物素化肽（pHMRSK公司)或非磷酸化（HMRSK公司)使用Ser386对传感器芯片SA进行涂层（10个响应单元）。（1） 将不同浓度（0.013–3.33µM）的GST–PDK1注射到pHM涂层芯片上。在插图中，根据PDK1的不同浓度绘制了稳态结合曲线。使用Kaleidabrograph软件将数据拟合为双曲线，从而获得动力学常数。（2和3）将GST–PDK1野生型、–R131A或–R131M以400 nM注入涂有pHM的芯片RSK公司和HMRSK公司分别是。（A）和（B）中的所有实验进行了三次，结果相似。
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图4。R131对PDK1磷酸化S6K1的能力很重要。野生型或T412E His-S6K11–421与野生型或突变型GST–PDK1和Mg[γ-32P] ATP。随后，对激酶反应进行SDS-PAGE。对纳入S6K1蛋白带的放射性进行量化，并以获得的最大值的百分比表示。结果代表了两个独立的实验。
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图5。磷酸结合囊在主要生长因子激活的AGC激酶中保守。(一个)在含有疏水囊的激酶结构域区域以及形成疏水基序的区域中，对选定的AGC激酶进行氨基酸序列比对。预测与磷酸基团相互作用的保守残基、疏水基序的前两个芳香残基和最后一个芳香残基分别用箭头、星号和圆圈表示。指出了所有激酶中保守的赖氨酸和谷氨酸残基之间的离子对形成。(B类和C类)RSK2和PKBα疏水口袋与其各自磷酸化疏水基序FRGFpSFV（RSK2）和FPQFpSYS（PKBα）的分子内相互作用模型。（B） 口袋的静电表面电位模型，蓝色为正电位，红色为负电位。疏水基序肽显示为白色，磷酸基团显示为黄色。（C） 带有文本中讨论的残留物侧链的口袋的带状表示。疏水基序肽显示为绿色，磷酸基显示为黄色。
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图5。磷酸结合囊在主要生长因子激活的AGC激酶中保守。(一个)在含有疏水囊的激酶结构域区域以及形成疏水基序的区域中，对选定的AGC激酶进行氨基酸序列比对。预测与磷酸基相互作用的保守残基、疏水基序的前两个芳香残基和最后一个芳香残基分别用箭头、星号和圆圈表示。指出了所有激酶中保守的赖氨酸和谷氨酸残基之间的离子对形成。(B类和C类)RSK2和PKBα疏水口袋与其各自磷酸化疏水基序FRGFpSFV（RSK2）和FPQFpSYS（PKBα）的分子内相互作用模型。（B） 口袋的静电表面电位模型，蓝色为正电位，红色为负电位。疏水基序肽显示为白色，磷酸基团显示为黄色。（C） 带有文本中讨论的残留物侧链的口袋的带状表示。疏水基序肽显示为绿色，磷酸基团显示为黄色。
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图6。磷酸化疏水基序对AGC激酶分子内激活的证据。(一个–E类)上面板：RSK2、S6K1、MSK1、PKBα和SGK1的野生型或点突变激酶结构域，均缺乏疏水基序（SGK1除外61–431)，被PDK1预磷酸化或不被PDK1预磷酸化。此后，去除PDK1（RSK2分析中除外）。然后，在170µM（A、B和E）或360µM（C和D）的磷酸化（pHM）或非磷酸化（HM）疏水基序肽缺失或存在的情况下测定每个激酶的活性，并以最大活性的百分比表示。数据是（A）2–4个独立实验的4–10个观察值的平均值±SD，（B–D）三个独立实验或（E）重复样本的平均值，重复样本之间的差异小于5%，重复样本来自两次进行的具有类似结果的实验（A–D，下部面板）。为了控制等量的蛋白质和PDK1诱导的野生型和突变型激酶磷酸化，对反应的小份进行SDS-PAGE和蛋白质染色/抗-HA印迹或用PDK1位点的磷酸特异性抗体进行印迹。然而，在（A）中，HA-RSK2的磷酸化1–373通过包括[γ-32P] ATP与PDK1预孵育，然后与抗HA抗体沉淀，SDS-PAGE和放射自显影。
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图6。磷酸化疏水基序对AGC激酶分子内激活的证据。(一个–E类)上面板：RSK2、S6K1、MSK1、PKBα和SGK1的野生型或点突变激酶结构域，均缺乏疏水基序（SGK1除外61–431)，被PDK1预磷酸化或不被PDK1预磷酸化。此后，去除PDK1（RSK2分析中除外）。然后，在170µM（A、B和E）或360µM（C和D）的磷酸化（pHM）或非磷酸化（HM）疏水基序肽缺失或存在的情况下测定每个激酶的活性，并以最大活性的百分比表示。数据是（A）2–4个独立实验的4–10个观察值的平均值±SD，（B–D）三个独立实验或（E）重复样本的平均值，重复样本之间的差异小于5%，重复样本来自两次进行的具有类似结果的实验（A–D，下部面板）。为了控制等量的蛋白质和PDK1诱导的野生型和突变型激酶磷酸化，对反应的小份进行SDS-PAGE和蛋白质染色/抗-HA印迹或用PDK1位点的磷酸特异性抗体进行印迹。然而，在（A）中，HA-RSK2的磷酸化1–373通过包括[γ-32P] ATP与PDK1预孵育，然后与抗HA抗体沉淀，SDS-PAGE和放射自显影。
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图6。磷酸化疏水基序对AGC激酶分子内激活的证据。(一个–E类)上面板：RSK2、S6K1、MSK1、PKBα和SGK1的野生型或点突变激酶结构域，均缺乏疏水基序（SGK1除外61–431)，被PDK1预磷酸化或不被PDK1预磷酸化。此后，去除PDK1（RSK2分析中除外）。然后，在170µM（A、B和E）或360µM（C和D）的磷酸化（pHM）或非磷酸化（HM）疏水基序肽缺失或存在的情况下测定每个激酶的活性，并以最大活性的百分比表示。数据是（A）2–4个独立实验的4–10个观察值的平均值±SD，（B–D）三个独立实验或（E）重复样本的平均值，重复样本之间的差异小于5%，重复样本来自两次进行的具有类似结果的实验（A–D，下部面板）。为了控制等量的蛋白质和PDK1诱导的野生型和突变型激酶磷酸化，对反应的小份进行SDS-PAGE和蛋白质染色/抗-HA印迹或用PDK1位点的磷酸特异性抗体进行印迹。然而，在（A）中，HA-RSK2的磷酸化1–373通过包括[γ-32P] ATP与PDK1预孵育，然后与抗HA抗体沉淀，SDS-PAGE和放射自显影。
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图7。RSK2与其磷酸化疏水基序的相互作用。通过表面等离子共振测量分析了RSK2与其自身疏水基序的相互作用。生物素化pHMRSK公司该肽用于覆盖传感器芯片SA（500个响应单位），并测试其与GST–HA-RSK2的结合1–373或GST–HA-RSK21–373R119A。实验进行了多次，结果相似。
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图8。磷酸结合精氨酸在AGC激酶活化和磷酸化中的作用体内用表达HA或GST标记的野生型或突变型激酶的质粒转染COS7细胞。在48小时和最后4小时的血清饥饿期后，将细胞暴露于20 nM EGF中20分钟或1µM胰岛素中8分钟，如图所示，然后进行裂解。此后，用HA标签抗体或谷胱甘肽珠从细胞裂解液中沉淀激酶。(一个)测定激酶活性，并将其表示为野生型刺激值的百分比。数据是三个（RSK2、S6K1、MSK1和SGK1）或四个（PKBα）独立实验的平均值±SD，重复进行。(B类)对（A）沉淀的激酶进行SDS-PAGE分析。用指示的抗磷酸肽抗体对凝胶进行免疫印迹或蛋白质染色。
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图9。磷酸结合囊在生长因子激活的AGC激酶调节中的作用。(一个)AGC激酶的激活机制可分为发散激活步骤和共同激活步骤。在这两个步骤中，磷酸结合囊对磷酸丝氨酸/磷酸苏氨酸的识别可能起到关键作用，如这里的RSK和PKB所示。（1） 在发散步骤中，激酶通过位于激酶结构域两侧的信号传导模块受到路径特异性调节，从而导致疏水基序磷酸化（在RSK中由C末端激酶结构域磷酸化，在PKB中由一个未知激酶磷酸化）。在RSK（和S6K或SGK）中，疏水基序的磷酸盐随后被PDK1的磷酸盐结合囊识别，导致PDK1募集并随后磷酸化激活环。因此，调节性磷酸化以强制性顺序发生。在PKB中，PDK1通过PH结构域介导的细胞膜共定位被募集，因此调节磷酸化的顺序似乎不是强制性的。（2） 第二个激活步骤可能是所有含有磷酸化疏水基序的AGC激酶共同的，因此PKC、Rho激酶和Ndr也不在此研究。在这一步中，磷酸结合位点促进疏水基序与AGC激酶结构域内的疏水囊的分子内结合。与活化环磷酸化相一致，这导致激酶结构域的构象变化，从而导致催化活化。(B类)（A）中使用的主要符号的键。
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图10。疏水基序和激活环的磷酸盐如何协同激活AGC激酶的模型。图5B中RSK2模型与其疏水基序相互作用的带状表示，但从另一个角度来看，显示了整个RSK2激酶结构域。该图说明了疏水基序和活化环的磷酸盐如何协同定位C螺旋，以优化Glu118和ATP-结合Lys100的离子配对。此外，由疏水基序固定的C螺旋可以在大小叶之间起到桥梁的作用，以使激酶稳定在闭合（活性）构象中，如图所示。
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