Pax3-FKHR knock-in mice show developmental aberrations but do not develop tumors

doi:10.1128/MCB.22.20.7204-7216.2002

.2002年10月；22(20):7204-16.

doi:10.1128/MCB.22.20.7204-7216.2002。

Pax3-FKHR敲除小鼠表现出发育异常，但不会发展成肿瘤

伊琳娜·拉古蒂娜¹, 西蒙·康威, 杰克·苏布雷特, 杰拉德·C·格罗夫尔德

附属公司

PMID： 12242297
预防性维修识别码：项目经理139793
内政部： 10.1128/立方米.22.20.7204-7216.2002

Pax3-FKHR敲除小鼠表现出发育异常，但不会发展成肿瘤

伊琳娜·拉古蒂娜等。分子细胞生物学. 2002年10月.

.2002年10月；22(20):7204-16.

doi:10.128/MCB.22.20.7204-7216.2002。

作者

伊琳娜·拉古蒂娜¹, 西蒙·康威, 杰克·苏布雷特, 杰拉德·C·格罗夫尔德

附属

¹遗传学系。美国田纳西州孟菲斯市圣裘德儿童研究医院传染病科，邮编38105。

PMID： 12242297
预防性维修识别码：项目经理139793
内政部： 10.1128/立方米.22.20.7204-7216.2002

摘要

肺泡横纹肌肉瘤是一种由反复发生的染色体易位t（2；13）和t（1；13）引起的儿童疾病。这些易位导致PAX3-FKHR和PAX7-FKHR融合基因的形成，这些基因被认为在该疾病的发生中起因果作用。尽管PAX3-FKHR在永生化成纤维细胞系中表现出转化活性，但该融合蛋白在体内肿瘤发生中的直接作用尚未显示。我们确定Pax3-FKHR在小鼠生殖系中的表达是否会使这些动物容易发生横纹肌肉瘤。通过将FKHR cDNA序列靶向胚胎干细胞的Pax3位点，我们利用这些细胞生成携带Pax3-FKHR-敲除等位基因的小鼠。尽管敲入等位基因的表达较低，但Pax3-FKHR嵌合体小鼠的杂合子代表现出发育异常。这些包括脑室间隔缺损、三尖瓣关闭不全和膈肌缺损，这些都会导致充血性心力衰竭，导致围产期死亡。此外，Pax3-FKHR杂合子代表现出一些但不是所有后轴肌肉的畸形。然而，无论是杂合子新生幼崽还是嵌合双亲均未显示任何恶性迹象。我们得出结论，Pax3-FKHR等位基因会导致敲除小鼠出现致命的发育缺陷，但可能不足以导致肌肉肿瘤。

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数字

**图1。**
（A）生成*Pax3-FKHR公司*ES细胞中同源重组的敲除等位基因。顶部栏表示鼠标的物理映射*帕克3*包含外显子6和7周围区域的基因（灰色框）。中间的栏显示了靶向结构，其中第7外显子*帕克3*与的外显子2融合*FKHR公司*（粗阴影框），后面跟着Neo^第页基因（精细阴影框）的转录方向相反。TK可选标记（黑盒）位于5′端。底线代表目标*Pax3-FKHR公司*等位基因。在目标等位基因的下面，指示了用于Southern杂交的外部5′和3′探针的位置。水平箭头表示用于基因分型和RT-PCR的引物位置（表1）。P、，*Pst（磅/平方英尺）*我；S、，上海我；A、，阿帕我；B、，巴姆你好；X、，*Xho公司*I.（B）带有5′探针的Southern blot，显示野生型（wt）和靶向型*Pax3-FKHR公司*野生型胚胎中的（+/-）等位基因和*Pax3-FKHR公司*杂合子同卵。（C） 3′探针显示野生型（wt）和靶向性的Southern blotPax3-FKHR公司（+/-）等位基因。（D）中间（左上）和高度嵌合（左下和右下）*Pax3-FKHR公司*嵌合体小鼠，头部、腹部和背部出现白色斑点。

**图2。**
*Pax3-FKHR公司*在妊娠早期和中期的胚胎中以及在分化的胚状体中的表达。（A） E10.5野生型和*Pax3-FKHR公司*同窝胚胎，使用亲和纯化的Pax3抗体。（B）来自E14.5胚胎的心脏RNA的RT-PCR；均匀车道，野生型RNA；奇数车道，突变RNA；车道1和2，第一轮RT-PCR帕克3; 车道3和4，RT-PCRPax3-FKHR公司; 通道5和6，半嵌套PCRPax3-FKHR公司（C）E10.5胚胎全RNA的RT-PCR。车道：1和2，第一轮RT-PCR帕克3带有野生型RNA和*帕克3 FKHR*^+/−胚胎；3和4，第一轮RT-PCRPax3-FKHR公司带有野生型RNA和*Pax3-FKHR公司*^+/−胚胎；5和6，半嵌套RT-PCRPax3-FKHR公司带有野生型RNA和*Pax3-FKHR公司*^+/−胚胎；m、 1-kb标记。（D） E10.5胚胎解剖体部分RNA的RT-PCR。车道：1至8条第一轮RT-PCR帕克3含有野生型RNA（1到4道）和*Pax3-FKHR公司*^+/−（5至8道）胚胎；9至16个半嵌套RT-PCRPax3-FKHR公司含有野生型RNA（9到12道）和*Pax3-FKHR公司*^+/−（13至16道）胚胎；1、5、9和13，神经管；2、6、10和14个体节和肢芽；3、7、11和15，咽弓；4、8、12、16、胚胎剩余部分；m、 1-kb标记。底漆：用于*Pax3，*1和4；第一轮*Pax3-FKHR公司*RT-PCR，1和7；对于半嵌套*Pax3-FKHR公司*PCR，1和6（图1A；表1）。（E）*逆转录聚合酶链式反应*分化类胚体。泳道：1d至4d，胚状体的RT-PCR，在悬浮液中生长1至4天；在存在（+bFGF）或不存在（-bFGF）的情况下，悬浮生长1至5天后类胚体分化的4d+1至4d+5，RT-PCR；top凝胶，β-actin基因；顶部的第二个凝胶，*帕克3*; 顶部的第三个凝胶，*Pax3-FKHR公司*第一轮PCR；底部凝胶，*Pax3-FKHR公司*第二轮PCR。引物（图1；表1）：β-actin基因，9和10；*帕克3*、4和8；第一*Pax3-FKHR公司*PCR，7和8；半嵌套的*Pax3-FKHR公司*PCR，6和8。

**图3。**
P1野生型小鼠（a、D、G、J和M）和两只小鼠胸部横截面的苏木精-伊红染色*Pax3-FKHR公司*杂合小鼠（一只出生时死亡，[B、E、H、K和N]，另一只存活[C、F、I、L和O]）。（A至C）肺部。野生型新生儿的肺（a），死者的肺*Pax3-FKHR公司*肺未充气的新生儿（B）*Pax3-FKHR公司*肺膨胀的新生儿（C）。（D到F）心脏。与野生型心脏（D）相比，两个突变心脏的室间隔和小梁室壁异常（厚[E]或薄[F]）；变异心脏（F）的三尖瓣开口也异常大（箭头所示）。（G至I）室间隔。VSD在*Pax3-FKHR公司*敲入突变体（面板H和I中的箭头）。（J至L）心脏的Rostral切片。左右肺动脉都是开放的，并连接到正确的肺；突变体的胸腺有一个异常的、更靠近尾部的位置（K和L中的星号）；下腔静脉过度扩张，表明心力衰竭（对比J和K面板中的VC）。（男至女）肝脏。肝脏*Pax3-FKHR公司*敲除杂合子胚胎充血（N和O），提示心脏衰竭。缩写：rV，右心室；lV，左心室；S、隔膜；rP，右肺干；lP，左肺干；dA，降主动脉；O、食道。

**图4。**
E16.5野生型和非野生型心脏室间隔和流出道的解剖*Pax3-FKHR公司*杂合胚胎和Pax3表达。（A至D）野生型（A和C）和突变型（B和D）心脏横切面的苏木精和伊红染色。杂合突变体室间隔的肌肉成分已经异常增厚（图B中的星号）；心脏流出道*帕克3 FKHR*小鼠被适当地分开，但流出道的肺干部分的管腔扩张（比较面板C和D）。（E） E16.5心脏中Pax3和Pax3-FKHR的表达*Pax3-FKHR公司*胚胎。（F）高倍镜下观察壁板E。绿色，亚甲基绿核染色；紫色，α-肌球蛋白重链染色；棕色，用抗Pax3染色。

**图5：。**
膈肌和舌肌*Pax3-FKHR公司*杂合子幼崽在出生前后是异常的，但在E13.5时不是。（A至D）P1野生型（A和B）和*Pax3-FKHR公司*敲入（C和D）横膈膜显示突变横膈膜的肌肉组织大大减少。（E） P1的矢状截面*Pax3-FKHR公司*隔膜显示间隙（星号）。E13.5野生型（F）和*Pax3-FKHR公司*敲除（G）幼犬。绿色，亚甲基绿核染色；紫色，抗BrdU染色；棕色，用抗Pax3染色。P1野生型（H和I）舌类似矢状切面的（H至K）苏木精和伊红染色*Pax3-FKHR公司*突变（J和K）幼崽。缩写：d，隔膜；李，肝脏；卢，肺。

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