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.2002年10月；22(20):7004-14.
doi:10.1128/MCB.22.20.7004-7014.2002。

雷帕霉素哺乳动物靶点对低氧诱导因子1alpha表达和功能的调节

克里斯汀·哈德森 1, 刘梅（音）, 加里·蒋, 黛安·M·奥特尼斯, 黎明C鲁米斯, 菲奥娜·卡珀, 阿马托·J·贾西亚, 罗伯特·T·亚伯拉罕
附属公司

雷帕霉素哺乳动物靶点对低氧诱导因子1alpha表达和功能的调节

克里斯汀·哈德森等。 分子细胞生物学. 2002年10月.

摘要

低氧诱导因子1（HIF-1）是一种异二聚体转录因子，包含一个诱导表达的HIF-1α亚基和一个组成性表达的HIFβ亚基。在低氧条件下，HIF-1α亚单位因蛋白水解降解速率的降低而积累，由此产生的HIF-1 alpha-HIF-1beta异二聚体经历翻译后修饰，促进反式激活。最近的研究表明，通过磷脂酰肌醇3-激酶及其下游靶点mTOR的信号放大，可以增强某些细胞类型中HIF-1依赖性基因的表达。在本研究中，我们进一步探讨了缺氧或缺氧模拟物CoCl（2）处理的PC-3前列腺癌细胞中mTOR和HIF-1之间的联系。用mTOR抑制剂雷帕霉素预处理PC-3细胞，可抑制缺氧或CoCl（2）诱导的HIF-1α和HIF-1依赖性转录的积累。用野生型mTOR转染这些细胞可通过缺氧或CoCl（2）增强HIF-1的激活，而雷帕霉素耐药mTOR突变体的表达可使HIF-1α稳定，HIF-1反式激活功能对雷帕霉素的抑制无效。对GAL4-HIF-1α融合蛋白的研究明确指出，氧依赖性降解结构域是雷帕霉素敏感性、mTOR依赖性信号通路的关键靶点，该信号通路可通过CoCl稳定HIF-1β（2）。这些研究将mTOR定位为癌细胞HIF-1功能的上游激活剂，并表明雷帕霉素的抗肿瘤活性部分通过抑制细胞对缺氧应激的反应来介导。

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数字

图1。
图1。
缺氧或氯化钴刺激HIF-1转录活性和HIF-1α蛋白稳定2（A）用pHRE-Luc报告质粒转染PC-3细胞。24小时后，细胞在2%或0.1%FBS中培养6小时，然后用溶剂载体、50μM LY294002或100 nM雷帕霉素预处理30分钟。然后将细胞暴露于常压条件、缺氧或150μM CoCl中19小时2荧光素酶活性用光度计测量，并以相对光单位（RLU）表示。误差条表示重复样本的方差。（B） 雷帕霉素对GLUT1公司mRNA表达。PC-3细胞在含有2%血清的培养基中培养以获得低氧样本（上图），或在含有0.1%血清的培养液中培养以获取CoCl2刺激（下面板）。将细胞暴露于缺氧或150μM CoCl中8小时2采集细胞总RNA进行半定量RT-PCR分析之前。
图1。
图1。
缺氧或氯化钴刺激HIF-1转录活性和HIF-1α蛋白稳定2（A）用pHRE-Luc报告质粒转染PC-3细胞。24小时后，细胞在2%或0.1%FBS中培养6小时，然后用溶剂载体、50μM LY294002或100 nM雷帕霉素预处理30分钟。然后将细胞暴露于常压条件、缺氧或150μM CoCl中19小时2荧光素酶活性用光度计测量，并以相对光单位（RLU）表示。误差条表示重复样本的方差。（B） 雷帕霉素对GLUT1公司mRNA表达。PC-3细胞在含有2%血清的培养基中培养以获得低氧样本（上图），或在含有0.1%血清的培养液中培养以获取CoCl2刺激（下面板）。将细胞暴露于缺氧或150μM CoCl中8小时2采集细胞总RNA进行半定量RT-PCR分析之前。
图2。
图2。
（A） PC-3细胞在含有2或0.1%FBS的培养基中预培养，用指定的药物处理，然后暴露于常氧（Co）或缺氧，如图1A图例所示。细胞被裂解，洗涤剂可溶性蛋白被SDS-PAGE溶解。依次用α-HIF-1αMAb和α-PLCγ1抗体对膜进行免疫印迹。对免疫印迹进行密度分析，并将数值归一化为正常毒性对照样品中获得的数值。（B） PC-3细胞按照上述方法处理，但细胞受到150μM CoCl的刺激2（C）在不存在雷帕霉素的情况下，将细胞暴露于缺氧中2或6小时，并按照面板A中的描述处理样品。通过密度测定法对条带强度进行量化，底部面板下方的数字表示每个时间点非药物治疗对照的百分比。
图3。
图3。
雷帕霉素对HIF-1活性和HIF-1α表达的相关抑制作用。用pHRE-Luc报告质粒转染PC-3细胞，24小时后，将细胞置于含2%血清的培养基中。8小时后，用100 nM雷帕霉素处理指示样品，并在常氧或缺氧条件下再培养16小时。（上面板）采集样本以测定荧光素酶活性。条形图和误差标志表示三份样品的平均值±标准偏差。（下面板）采集平行样品，用α-HIF-1αMAb免疫印迹洗涤剂可溶性蛋白。去除印迹，并用PLCγ1特异性抗体进行重复，以控制样品装载。
图4。
图4。
雷帕霉素对HIF-1α转换的影响。（A） 蛋白酶体抑制拮抗雷帕霉素对缺氧诱导的HIF-1α表达的抑制作用。（左面板）PC-3细胞在2%FBS中培养6小时，然后用溶剂载体、雷帕霉素（Rap）或LLnV预处理45分钟。细胞在常氧（−）或缺氧（H）条件下培养。16小时后收集细胞，通过SDS-PAGE解析可溶性蛋白。（右侧面板）PC-3细胞在所示药物治疗前在0.1%FBS中预培养16小时，然后用150μM CoCl刺激6小时2（C） ●●●●。用α-HIF-1αMAb和α-PLCγ1抗体依次检测印迹蛋白。通过密度计定量HIF-1α蛋白的表达，并将其归一化为相应的常氧对照样品中获得的值。（B） LLnV诱导的HIF-1α积累。在无或存在100 nM雷帕霉素的情况下，在常压条件下，用10μM LLnV处理PC-3细胞指定的时间。通过免疫印迹法测定HIF-1α的表达，剥离印迹，并用α-PLCγ1抗体进行重复，以控制样品装载。所示结果代表了在三个独立试验中获得的结果。（C） 雷帕霉素对HIF-1α降解的影响。细胞在含有2%血清的培养基中培养，并暴露于缺氧过夜。然后用CHX处理细胞以阻断新的蛋白质合成，并将指示的样品同时暴露于100nM雷帕霉素。细胞在缺氧条件下维持指定的时间，HIF-1α水平通过免疫印迹法测定，如面板A所述。PLCγ1用作上述样品装载控制。
图5：。
图5：。
稳定转染PC-3亚系中HIF-1的激活。用编码AU1标记的野生型AmTOR（WT）或雷帕霉素耐药（Ser2035→Ile）AmTOR突变体（SI）。克隆亚系与pHRE-luc报告子共转染，并与雷尼利亚荧光素酶报告子（作为转染效率的对照）。24小时后，将培养基改为添加0.1%FBS的RPMI 1640，再培养6小时。用溶剂载体或100 nM雷帕霉素预处理30分钟，然后用150μM CoCl刺激16小时2或缺氧。细胞裂解物接受双重荧光素酶分析，样本值根据转染效率的变化进行标准化雷尼利亚荧光素酶活性。误差条表示重复样本的方差。通过α-AU1免疫印迹法对等分的细胞提取物进行重组AmTOR蛋白表达分析（上面板）。（A） AmTOR-WT转染的亚克隆。（B） AmTOR-WT-和AmTOR-SI-转染亚克隆的比较。（C） PC-3细胞和稳定转染的WT或SI亚系在含有0.1%血清的培养基中预培养8 h，然后用载体或雷帕霉素处理。30分钟后，缺氧刺激细胞16小时。用α-HIF-1αMAb和α-PLCγ1抗体依次免疫印迹洗涤剂可溶性蛋白。通过密度分析测定HIF-1α水平，并计算雷帕霉素对每个样本集缺氧诱导HIF-1β表达的抑制百分比。在上面的面板中，用α-AU1 MAb免疫印迹分离的细胞提取物等分，以检测AmTOR-WT或AmTOR-SI蛋白的表达。
图6。
图6。
ODD结构域在mTOR调节HIF-1α表达中的作用。（A） HIF-1α功能域示意图。HIF-1α的结构域包括基本螺旋-环-螺旋（bHLH）和PER-ARNT-SIM（PAS）基序、羧基末端反式激活域（TAD N和C）和ODD域。监管的Pro-402和Pro-564残基（见正文）也突出显示。（B） 雷帕霉素对氯化钴的影响2-诱导G4-HIF-1α蛋白的稳定。用空载体（模拟）或编码所示G4-HIF-1α融合蛋白的质粒瞬时转染PC-3细胞。24小时后，将转染细胞在2%含血清培养基中培养2小时，并将指示样品暴露于缺氧条件下16小时，其中不含或含有100 nM雷帕霉素。用SDS-PAGE分离洗涤剂可溶性蛋白，并用α-G4-MAb进行免疫印迹，然后添加PLCγ1特异性抗体作为对照。
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参考文献

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