Mitochondrial respiratory control is lost during growth factor deprivation

doi:10.1073/pnas.202477599

.2002年10月1日；99(20):12801-6.

doi:10.1073/pnas.202477599。 Epub 2002年9月12日。

生长因子剥夺期间线粒体呼吸控制丧失

埃亚尔·戈特利布¹, 肖恩·M·阿莫尔, 克雷格·B·汤普森

附属公司

PMID： 12228733
预防性维修识别码： PMC130540型
内政部： 10.1073/pnas.202477599

生长因子缺乏期间线粒体呼吸控制丧失

埃亚尔·戈特利布等。美国国家科学院院刊. 2002.

.2002年10月1日；99(20):12801-6.

doi:10.1073/pnas.202477599。 Epub 2002年9月12日。

作者

埃亚尔·戈特利布¹, 肖恩·M·阿莫尔, 克雷格·B·汤普森

附属

¹美国宾夕法尼亚大学艾布拉姆森家庭癌症研究所和癌症生物学系，宾夕法尼亚州费城，邮编：19104。

PMID： 12228733
预防性维修识别码： PMC130540型
内政部： 2017年10月10日/第2477599页

摘要

细胞保持生物能量上有利的ATP/ADP比率的能力，使消耗ATP的细胞事件和ATP生成速率之间保持紧密平衡。然而，在退出生长因子后，细胞ATP/ADP比率下降。为了研究这些变化，体外对凋亡开始前分离的生长因子衍生细胞的线粒体进行了表征。生长因子缺乏细胞的线粒体已经失去了对ADP进行基质浓缩的能力，这伴随着ADP偶联呼吸的失败。在分析时，生长因子衍生细胞的线粒体没有耗尽细胞色素c，细胞色素c依赖的呼吸也没有受到影响，这表明呼吸速率的抑制不是由于细胞色素c的丢失。破坏线粒体外膜的药物，如洋地黄素、，或维持腺嘌呤核苷酸（如Bcl-x（L））的外膜交换，恢复ADP依赖的线粒体呼吸控制。总之，这些数据表明线粒体外膜通透性的调节有助于呼吸控制。

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数字

图1
从IL-3分泌细胞分离的线粒体对还原底物有反应，但对ADP无反应。将细胞在有或无IL-3的条件下保存12 h。分离线粒体，将其单独放置在反应缓冲液中（无底物=状态1）或与琥珀酸盐（+琥珀酸=状态4）或琥珀酸和ADP（+琥珀酸盐+ADP=状态3）一起放置5 min，然后进行固定和EM分析。暗区（较高的电子密度）对应于基体。

图2
来自IL-3脱附细胞的线粒体显示ADP-耦合呼吸减少。(A类)细胞在有或无IL-3的条件下维持12小时，然后分离线粒体。将线粒体（500μg）稀释到含有鱼藤酮和琥珀酸盐的反应缓冲液中，并记录氧含量。记录状态4呼吸200秒，然后添加ADP以诱导状态3呼吸。(B类)从对照（+IL-3）或IL-3缺失（-IL-3）细胞分离的线粒体在状态4和状态3下的耗氧速率。结果是3个独立实验的平均值和标准偏差。

图3
细胞色素*c（c）*IL-3戒断后RCR的下降不能用IL-3的损失来解释。(A类)细胞色素*c（c）*-使用在有或无IL-3条件下生长12小时的细胞线粒体测量依赖性呼吸。分离后，线粒体（500μg）在抗霉素A存在下稀释到反应缓冲液中。如有指示，TMPD和抗坏血酸作为细胞色素的电子供体*c（c）*，添加到腔室中。(B类)在存在或不存在外源细胞色素的情况下，从对照（+IL-3）或IL-3缺失（−IL-3）细胞分离的线粒体的琥珀酸介导呼吸的RCRc（c）制备线粒体并进行分析，如图2所示。(C类上部)从存在IL-3的细胞中分离出线粒体，并与tBid或不与tBid孵育5分钟(下部)在存在或不存在外源细胞色素的情况下分析双处理线粒体*c（c）*加入鱼藤酮和琥珀酸后，在呼吸计中对样品进行分析，如图2所示。(D类)用tBid处理或不处理线粒体的RCR，无论是否有外源细胞色素*c（c）*如所示C类.

图4
洋地黄素会破坏线粒体外膜，但不会导致细胞色素的大量释放*c（c）*. (A类)从对照（+IL-3）或IL-3脱辅（−IL-3）细胞中分离出线粒体，并保存在无底物的隔离缓冲液（MIB）中。如有指示，添加洋地黄素，并按照*材料和方法*并进行EM分析。箭头表示外膜的不同类型损伤，包括1）膜夹伤，2）小间隙，3）大间隙。(B类)细胞色素*c（c）*（cytc）水平与细胞色素*c（c）*氧化酶（COX IV）水平，作为负载对照，通过从在有或没有IL-3的存在下生长12小时的细胞中分离的线粒体的蛋白质印迹分析来评估，有或没有洋地黄素处理。

图5
洋地黄素治疗可恢复从IL-3分泌细胞分离的线粒体对ADP的反应。从存在或不存在IL-3的细胞中分离线粒体12小时。用洋地黄素处理或不处理线粒体，并在呼吸计中进行分析，如图2所示。在缺乏外源性细胞色素的情况下进行呼吸*c（c）*. (A类)来自对照（+IL-3）细胞的线粒体。(B类)剥夺IL-3 12小时的细胞线粒体(C类)从有或无IL-3的细胞中分离出的线粒体的RCR，并用或不用洋地黄素孵育。结果是3个独立实验的平均值和标准偏差。

图6
膜透性电子供体恢复IL-3脱附细胞线粒体的非耦合呼吸及Bcl-x对耦合呼吸减少的预防作用_L（左）表达式。(A类)用杜洛喹醇作为电子供体对未偶联线粒体的呼吸分析。在鱼藤酮和羰基氰化物存在的反应缓冲液中培养来自对照细胞或IL-3衍生细胞的线粒体（500μg）米-氯苯腙。如有指示，向试验箱中添加100μM杜洛喹醇（DQH2）。(B类)用控制载体（Neo）或编码Bcl-x的载体转染FL5.12细胞_L（左）（四十）将线粒体（500μg）稀释到鱼藤酮存在的反应缓冲液中，并测量耗氧量。记录状态1呼吸（无底物）100秒，然后添加琥珀酸。200秒后加入ADP诱导状态3呼吸。

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