Fluorescence resonance energy transfer detection of synaptophysin I and vesicle-associated membrane protein 2 interactions during exocytosis from single live synapses

doi:10.1091/mbc.e02-01-0036

.2002年8月；13(8):2706-17.

doi:10.1091/mbc.e02-01-0036。

荧光共振能量转移检测单个活突触胞吐过程中突触素I和囊泡相关膜蛋白2的相互作用

玛丽亚·潘努托¹, 大卫·邓拉普, 安德里亚·孔塔比莱, 法比奥·本菲纳蒂, 弗拉维亚·瓦尔托塔

附属公司

PMID： 12181340
预防性维修识别码：项目经理117936
内政部： 10.1091/mbc.e02-01-0036

荧光共振能量转移检测单个活突触胞吐过程中突触素I和囊泡相关膜蛋白2的相互作用

玛丽亚·潘努托等。分子生物学细胞. 2002年8月.

.2002年8月；13(8):2706-17.

doi:10.1091/mbc.e02-01-0036。

作者

玛丽亚·潘努托¹, 大卫·邓拉普, 安德里亚可参赛, 法比奥·本菲纳蒂, 弗拉维亚·瓦尔托塔

附属

¹意大利米兰S.Raffaele科学研究所和Vita-Salute大学神经科学系。

PMID： 12181340
预防性维修识别码：项目经理117936
内政部： 10.1091/mbc.e02-01-0036

摘要

为了研究突触素I和囊泡相关膜蛋白2（VAMP2）/突触素II在胞吐过程中的分子相互作用，我们使用延时视频显微镜测量了活神经元中的荧光共振能量转移。为此，与突触素I或VAMP2融合的荧光蛋白变体在大鼠海马神经元中表达。我们发现突触素I和VAMP2在突触囊泡膜上形成同源和异质低聚物。当α-巨噬细胞毒素刺激胞吐时，即使在没有明显胞吐的情况下，VAMP2也会从突触素I中分离出来，而突触素Ⅰ寡聚体只有在囊泡与质膜结合时才会分解。我们认为突触素I在神经递质释放中具有多重作用，调节可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体复合体的VAMP2可用性，并可能参与胞吐的后期步骤。

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图1
连续照明期间施主荧光衰减的时间过程。该图显示了使用12位单色摄像机在一系列延时图像中测量的SypI-ECFP转染海马神经元的荧光强度示例。分别对一个视野中的单个像素进行测量（总像素数为634）。平均并绘制每个时间点的强度值。

图2
SypI和VAMP2荧光融合蛋白的表达和靶向性。（A）融合蛋白在细胞中被正确翻译。用编码SypI-ECFP（第1和第3道）、SypI-EYFP（2和第4道）、ECFP-VAMP2（第5和第7道）或EYFP-VAMP2（第6和第8道）的表达载体瞬时转染Cos-7细胞。转染72小时后，用抗绿色荧光蛋白（1、2、5和6道）和抗SypI（3和4道）或抗VAMP2（7和8道）抗体进行免疫印迹分析细胞。（B）荧光蛋白与SV蛋白的融合不会改变荧光团的光谱特性。在瞬时转染的Cos-7细胞悬浮液中测量嵌合体的激发（固体）和发射（虚线）光谱。（C）外源性SV融合蛋白靶向转染神经元中的突触泡。海马神经元与编码SypI-EYFP和ECFP-VAMP2的表达载体共转染，并用抗SV2或抗MAP2抗体进行免疫荧光处理。（a–d）ECFP-VAMP2（a）和SypI-EYFP（b）与SV2（c）的彩色化，以及a、b和c（d）的叠加。（e–h）ECFP-VAMP2（e）和SypI-EYFP（f）与MAP2（g）缺乏共定位，e、f和g（h）重叠。棒材，10μm。

图3
突触波顿对α-Ltx反应的异质性。在15 DIV时，与编码ECFP-VAMP2和SypI-EYFP（a–a“和b–b”）或SypI-ECFP和EYFP（c–c“和d–d”）的载体共同转染的海马神经元在Ca中孵育30分钟²⁺-无或存在0.1 nMα-Ltx的游离培养基（KRH/EGTA）。差异对比度图像（a–d）、SypI-EYFP（a′和b′）、Syp I-ECFP（c′和d′）、ECFP-VAMP2（a“和b”）和EYFP（c“和d”）。注意，在中毒处理样品中存在两类不同的突触泡：一类突触泡的直径在对照样品中观察到的范围内（箭头），另一类突触泡的直径大得多（箭头）。SypI和VAMP2荧光嵌合体仅存在于突触，而可溶性EYFP分布于转染细胞的整个轴突。棒材，10μm。

图4
突触泡的大小反映了α-Ltx诱导的胞吐的程度。海马神经元（16 DIV）在去极化溶液中90 s孵育期间加载FM1-43。在时间0和在无或存在0.1 nMα-Ltx的KRH/EGTA中孵育40分钟后，记录DIC（a，c，a′和c′）和FM1-43（b，d，b′和d′）图像。毒素处理后，肿胀的突触突（a′和c′中的箭头）几乎释放了所有染料（比较b′和d′中的箭头），而染料保留在小突触突（比较b′和d′中的箭头）中，这些突触突在大小和亮度上与未处理样品相似（比较b和d中的箭头）。棒材，10μm。

图5
α-Ltx诱导SV胞吐而不影响细胞完整性。在不存在（a）或存在（b和c）1 nMα-Ltx的情况下，在KRH/EGTA中培养海马神经元（15 DIV）5分钟。在37°C下用抗SypI（a和b）或抗突触素I（C）抗体孵育1小时后，固定细胞并进行间接免疫荧光处理。注意α-Ltx处理的末端（b）中SypI的明亮染色，这与SV融合后蛋白的一些表位暴露于细胞外空间的概念一致（Valtorta等。, 1988). 突触素I（c）是一种与SV膜的细胞溶质侧相关的蛋白质，其染色缺失表明α-Ltx不会导致质膜的损伤和渗透。棒材，10μm。

图6
α-Ltx与各类突触泡结合。在不存在（a和a′）或存在（b和b′）0.1nMα-Ltx的情况下，将16DIV的海马神经元与KRH/EGTA中的Cy3偶联的抗α-Ltx抗体在37°C下孵育30分钟。（a和b）微分干涉对比（a′和b′）荧光。箭头和箭头分别表示突触隆起或正常大小。

图7
胞吐过程中SypI齐聚和SypI-VAMP2相互作用。对与编码SypI-ECFP/SypI-EYFP（SypI*SypI）、ECFP-VAMP2/SypI-EWP（Syp1*-VAMP2）、ECFP-VAMP2/EYFP2（VAMP2*VAMP2）或SypI-EFFP/SytI-EYFP（Syp I*SytI）的表达载体共转染的海马神经元（15-18 DIV）进行FRET测量。在Ca中孵育30分钟后测量FRET²⁺-无或存在0.1 nMα-Ltx的游离培养基（KRH/EGTA）。在中毒处理的样本中，分离正常大小和肿胀的突触束进行分析。（A）施主光漂白时间常数的分布。给出了典型实验的结果。SV*SV：表达两种荧光突触囊泡融合蛋白的样本；SV*cyt：表达一个荧光突触小泡融合蛋白和细胞溶质EYFP的对照样品。对于每个样本，平均分析35000像素。（B） FRET效率。SypI*SypI:FRET效率的变化表明SypI是SV膜上的同源寡聚体，寡聚物的解离发生在α-Ltx刺激的肿胀突触束中，即SV与质膜完全融合时。SypI*VAMP2：FRET效率的变化表明，VAMP2在SV膜上与SypI结合，并且VAMP2与Syp1的解离发生在α-Ltx刺激的小泡和肿胀的泡中，即SV与突触前膜融合之前。VAMP2*-VAMP2：FRET效率的变化表明，VAMP2分子在体内有一定程度的相互作用，并在α-Ltx刺激的小肿块和肿胀肿块中解离，即在融合前。SypI*SytI：缺乏显著的FRET表明SypI和SytI分子在体内没有显著的相互作用。所有条件下SypI*SytI FRET效率的负值表明SypI-ECFP和细胞溶质EYFP之间FRET的概率略高于SypI-EC FP和SytI-EYFP。E值表示三到五个实验的平均值±SEM。在每次实验中，对每类300-1800桶进行测量。**p<0.01，*p<0.02，学生的t吨测试与休息香肠++p<0.01，+p<0.05，平均值等于0的概率（见材料和方法）。

图8
供体光漂白时间常数分布的伪彩色图。施主光漂白的时间常数（τ_{bl（黑色）})可以用伪彩色图像描述（参见材料和方法），从而可以相对评估活细胞中蛋白质-蛋白质相互作用的时空动力学。SypI*SypI：与编码SypI-ECFP和SypI-EYFP的表达载体共转染的神经元。注意在静止条件下τ的异质性_{bl（黑色）}值在10到45秒之间。不均一性不仅存在于突触之间，也存在于单个突触内。经α-Ltx处理后，τ_{bl（黑色）}正常大小的突触束的值与未处理标本的值相似，而肿胀的突触囊的值在1-9 s范围内紧密分组。SypI*VAMP2：与编码ECFP-VAMP2和SypI-EYFP的表达载体共转染的神经元。在静止条件下，τ_{bl（黑色）}数值范围从10到45秒不等，而在α-Ltx处理的样本中，它们在正常大小和肿胀的突触发作中都降低到了一个均匀的水平。棒材，10μm。

图9
SV胞吐过程中SypI-SypI和SypI-VAMP2相互作用变化的示意图。在SV启动前，SypI作为低聚物存在于SV膜中，并与VAMP2相互作用，从而降低了其与t-SNAREs合成蛋白和可溶性SNARE复合物形成的可用性N个-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白-25。在启动时，但在融合前，VAMP2从SypI低聚物中释放出来，可能会接触到假定的突触前膜伙伴以启动融合孔。SypI低聚物只有在SV与质膜完全融合后才会解离，之后单体才能收集SV成分，为内吞取回做准备。

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