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。2002年8月；22(16):5897-911.
doi:10.1128/MCB.22.16.5897-5911.2002。

蛋白激酶C-整合素相互作用的定点扰动阻断癌细胞趋化性

梅迪·帕森斯 1, 梅兰妮·凯普勒, 亚当·克莱恩, 安西亚·梅森特, 马丁·汉弗莱斯, 露丝·吉尔克里斯特, 伊恩·哈特, Corinne Quittau-Prevestel公司, 威廉·E·休斯, 彼得·帕克, 掌控十亿级交易数据
附属公司

蛋白激酶C-整合素相互作用的定点扰动阻断癌细胞趋化性

梅迪·帕森斯等。 摩尔细胞生物学。 2002年8月。

摘要

细胞极化运动是肿瘤转移的必要条件；因此，干扰肿瘤细胞运动机制将显著改变其转移行为。蛋白激酶Cα（PKCα）与迁移细胞表型的促进有关。我们报道，乳腺癌细胞中佛波酯诱导的细胞极化和定向运动由PKCα-V3铰链结构域中的12-氨基酸基序（氨基酸313至325）决定。该基序也是PKCα和β1整合素之间直接关联所必需的。β1整合素与PKCα的有效结合需要整合素远端细胞质域中同时存在NPXY基序（细胞-2和细胞-3）。一种基于β1整合素PKC结合序列的细胞渗透抑制剂被证明可以阻断PKCα驱动的和表皮生长因子（EGF）诱导的趋化性。当通过逆转录病毒转导将其作为小基因导入人类乳腺癌细胞时，该抑制剂导致向EGF梯度的趋化性显著降低。总之，这些发现确定了PKCα和β1整合素之间的直接联系，这对肿瘤细胞定向迁移至关重要。重要的是，我们的发现概述了癌细胞趋化性如何增强的新概念，并为干扰肿瘤细胞扩散提供了概念基础。

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数字

图1。
图1。
不同GFP-PKCαRD结构对PDBu梯度诱导的MCF-7细胞迁移的影响。（A） 表达全长GFP-PKCα的MCF-7细胞或两个可变区域V3的RD结构[GFP-PKC-αRD+V3和GFP-PKC-αΔ（V1-PS）RD+V3]对PDBu梯度（Dunn室外孔1μM）表现出显著的定向趋化性(P（P）< 0.001,P（P）<0.001，以及P（P）分别<0.01）。瞬时表达GFP-PKCα（V1-PS）RD结构的细胞不包含V3区域或空载体，对梯度没有方向性(P（P）= 0.3). 未转染的细胞没有明显的方向运动。使用方差分析对三个独立实验中的追踪细胞与单独载体等效物进行比较。PDBu梯度（0°）的显著定向趋化性由高亮弧线表示，相应的P（P）值显示在相关位置。显示跟踪的单元格总数（N）。轨迹图显示了每个实验的整个时间过程中的所有细胞轨迹。每个点表示特定时间点的单元格位置，该时间点由每组单元格轨迹下的伪彩色刻度（以小时为单位的时间）表示。细胞轨道轴以微米为单位。（B） 表达GFP-PKCαRD+V3的细胞的定向细胞运动依赖于β1，而非αV整合素功能。将瞬时转染的细胞单独放置或与抗β1（P4C10）或抗αV整合素（L230）抑制MAb（10μg/ml）预孵育1 h，然后在存在相应阻断抗体的情况下进行上文所述的a组趋化性分析。（C） 双吲哚甲酰胺（BIM）抑制表达GFP-PKCαRD+V3细胞的定向细胞运动。
图1。
图1。
不同GFP-PKCαRD结构对PDBu梯度诱导的MCF-7细胞迁移的影响。（A） 表达全长GFP-PKCα的MCF-7细胞或两个可变区域V3的RD结构[GFP-PKC-αRD+V3和GFP-PKC-αΔ（V1-PS）RD+V3]对PDBu梯度（Dunn室外孔1μM）表现出显著的定向趋化性(P（P）< 0.001,P（P）<0.001，以及P（P）分别<0.01）。瞬时表达GFP-PKCα（V1-PS）RD结构的细胞不包含V3区域或空载体，对梯度没有方向性(P（P）= 0.3). 未转染的细胞没有明显的方向运动。使用方差分析对三个独立实验中的追踪细胞与单独载体等效物进行比较。PDBu梯度（0°）的显著定向趋化性由高亮弧线表示，相应的P（P）值显示在相关位置。显示跟踪的单元格总数（N）。轨迹图显示了每个实验的整个时间过程中的所有细胞轨迹。每个点表示特定时间点的单元格位置，该时间点由每组单元格轨迹下的伪彩色刻度（以小时为单位的时间）表示。细胞轨迹轴以微米为单位。（B） 表达GFP-PKCαRD+V3的细胞的定向细胞运动依赖于β1，而非αV整合素功能。将瞬时转染的细胞单独放置或与抗β1（P4C10）或抗αV整合素（L230）抑制MAb（10μg/ml）预孵育1 h，然后在存在相应阻断抗体的情况下进行上文所述的a组趋化性分析。（C） 双吲哚甲酰亚胺（BIM）抑制表达GFP-PKCαRD+V3的细胞的定向运动。
图2。
图2。
第三可变结构域（V3）是PKCα与包含细胞-2和细胞-3氨基酸基序的β1整合素细胞质肽的脂质依赖性结合所必需的。基于人β1整合素的细胞质序列合成了四个N末端生物素化重叠肽：KM（aa757-776）、KLLMIIHDRREFAKFEKEKM；HT（aa763-782），HDRREFAKFEKEKMNAKWDT；NT，（aa777-794），NAKWDTGENPIYKSAVTT；GK，（aa783-803），GENPIYKSAVTTVVNPKYEGK。（A） 在体外下拉试验中（如材料和方法所述），全长GFP-PKCα与β1整合素Cyto-2-和Cyto-3-肽GK结合最有效。对于每个样品，所有肽结合的GFP-PKCα（珠）与含有未结合蛋白的相应上清液（Sup）的五分之一一起运行。阴性对照区（−）表示仅用链霉亲和素偶联琼脂糖珠进行孵化。使用抗GFP多克隆抗血清（Clontech）进行免疫检测。图中显示了三个实验的代表性结果。（B） 通过将含有不同PKCα结构体的细胞提取物与含有PS和TPA（+脂质）的混合胶束预孵育，研究了WT PKCα和不同GFP标记的PKCαRD结构体与β1整合素细胞域肽GK21结合的脂质或激活剂需求，与无脂质或无激活剂对照（−脂质）相比。
图3。
图3。
β1整合素结合中PKCαRD的结构要求及其在MCF-7细胞中的定位。（A） 用不同GFP标记的PKCαRD构建物[GFP-Δ（V1-PS）RD+V3、GFP-△（V1-PS）RD和GFP-PKCαRD+V3]瞬时转染MCF-7细胞。用TPA（400 nM）刺激细胞，并在37℃孵育20分钟后固定°C，然后留作对照或用MAb 12G10 Fab染色（+12G10 Fab-Cy3）。显示了供体（GFP-PKCαRD）和受体（整合素12G10 Fab-Cy3）的荧光图像<τ> 是τ的平均值第页和τ米，其伪彩色比例适用于所有四个寿命映射。FRET效率（Eff）假彩色图仅适用于+12G10 Fab-Cy3寿命图（Eff=1−τ陆军部/τD类，式中τ陆军部是施主在受主和τ存在下的寿命图D类是在没有受体的情况下供体的平均寿命[至少四个GFP-PKC RD单独对照细胞的平均值<τ>的平均值]）。右侧的像素计数-相对-FRET效率图总结了不同RD结构在结合活化β1整合素[GFP-PKCαRD+V3（蓝色迹线）、GFP-PKC-αΔ（V1-PS）RD+V3]（红色迹线）和GFP-PKC-αΔ。GFP-PKCαRD+V3的结果与之前使用相同分析（16）发布的结果相似，并在像素计数-荧光定量荧光定量荧光效率图中进行总结以进行比较。GFP-PKCα供体单独的累积寿命（绿色）和在受体荧光团存在下测得的累计寿命（红色）(n个=5）绘制在右侧插入的二维图上。（B） 未刺激的、混有副甲醛的MCF-7细胞共聚焦图像，共表达RFP-PKCαΔ（V1-PS）RD+V3或RFP-PKC-αRD+V5和GFP-actin。棒材=10μm。（C） 用PDBu（1μM）模拟活MCF-7细胞共表达RFP-PKCαRD+V3（电影1）或RFP-PKC-αΔ（V1-PS）RD+V5（电影2）和GFP-actin的补充电影1和2的静态图像。帧001分别对应于向组织培养基中添加PDBu（1μM）后的1分钟（电影1）和3分钟（电影2）。按照材料和方法中的描述，采用时间推移序列。在拍摄过程中，有时必须手动调整显微镜以重新建立焦距，即使温度保持在37°C，高倍物镜的焦距也不太稳定。白色箭头指向RFP-PKCαRD+V3富集的小泡，这些小泡进出富含肌动蛋白的细胞皱褶（电影1），以及RFP-PKC-αΔ（V1-PS）RD+V3富集小泡，随着细胞对PDBu刺激的反应而突起，小泡定向流入前沿（电影2）。蓝色箭头指向细胞尾部，几乎没有RFP-PKCαRD+V3囊泡交通（电影1）和PDBu诱导的细胞突起（电影2）。（D） 第一组显示GFP-PKCαRD+V3与PKCδ共沉淀，以响应佛波酯（1μM PDBu）（+）的刺激。装载第一次离心后沉淀（unbound）后，蛋白G珠（bound）上的所有结合蛋白和细胞提取上清液中剩余的五分之一未结合蛋白。首先用兔抗PKCδ多克隆抗体探测含有抗PKCα（MAb MC5）免疫沉淀物的印迹，然后用抗GFP兔血清（Clontech）剥离并复制。重复运行+PDBu样本。显示了分子质量标记的位置。第二组是第一组实验的重复，使用模拟免疫沉淀（IP）控制（即免疫前血清免疫沉淀）；用兔抗GFP血清进行GFP-PKCαRD+V3免疫沉淀。
图3。
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β1整合素结合中PKCαRD的结构要求及其在MCF-7细胞中的定位。（A） 用各种GFP标记的PKCαRD构建体[GFP-Δ（V1-PS）RD+V3、GFP-Δ（V1-PS）RD和GFP-PKCαRD+V3]瞬时转染MCF-7细胞。用TPA（400 nM）刺激细胞，并在37℃孵育20分钟后固定°C，然后留作对照或用MAb 12G10 Fab染色（+12G10 Fab-Cy3）。显示了供体（GFP-PKCαRD）和受体（整合素12G10 Fab-Cy3）的荧光图像<τ> 是τ的平均值第页和τ米，其伪彩色比例适用于所有四个寿命映射。FRET效率（Eff）假彩色图仅适用于+12G10 Fab-Cy3寿命图（Eff=1−τ陆军部/τD类，式中τ陆军部是施主在受主和τ存在下的寿命图D类是在没有受体的情况下供体的平均寿命[至少四个GFP-PKC RD单独对照细胞的平均值<τ>的平均值]）。右侧的像素计数-相对-FRET效率图总结了不同RD结构在结合活化β1整合素[GFP-PKCαRD+V3（蓝色迹线）、GFP-PKC-αΔ（V1-PS）RD+V3]（红色迹线）和GFP-PKC-αΔ。GFP-PKCαRD+V3的结果与之前使用相同分析（16）发布的结果相似，并在像素计数-荧光定量荧光定量荧光效率图中进行总结以进行比较。GFP-PKCα供体单独的累积寿命（绿色）和在受体荧光团存在下测得的累计寿命（红色）(n个=5）绘制在右侧插入的二维图上。（B） 未刺激的、混有副甲醛的MCF-7细胞共聚焦图像，共表达RFP-PKCαΔ（V1-PS）RD+V3或RFP-PKC-αRD+V5和GFP-actin。棒材=10μm。（C） 用PDBu（1μM）模拟活MCF-7细胞共表达RFP-PKCαRD+V3（电影1）或RFP-PKC-αΔ（V1-PS）RD+V5（电影2）和GFP-actin的补充电影1和2的静态图像。帧001分别对应于向组织培养基中添加PDBu（1μM）后的1分钟（电影1）和3分钟（电影2）。按照材料和方法中的描述，采用时间序列。在拍摄过程中，必须不时手动调整显微镜以重新建立焦点，即使温度保持在37°C，高功率物镜的焦点也不太稳定。白色箭头指向RFP-PKCαRD+V3富集的小泡，这些小泡进出富含肌动蛋白的细胞皱褶（电影1），以及RFP-PKC-αΔ（V1-PS）RD+V3富集小泡，随着细胞对PDBu刺激的反应而突起，小泡定向流入前沿（电影2）。蓝色箭头指向细胞尾部，几乎没有RFP-PKCαRD+V3囊泡交通（电影1）和PDBu诱导的细胞突起（电影2）。（D） 图I显示了GFP-PKCαRD+V3与PKCδ的共沉淀，以响应佛波酯（1μM PDBu）（+）的刺激。装载第一次离心后沉淀（unbound）后，蛋白G珠（bound）上的所有结合蛋白和细胞提取上清液中剩余的五分之一未结合蛋白。首先用兔抗PKCδ多克隆抗体探测含有抗PKCα（MAb MC5）免疫沉淀物的印迹，然后用抗GFP兔血清（Clontech）剥离并复制。重复运行+PDBu样本。显示了分子质量标记的位置。第二组是第一组实验的重复，使用模拟免疫沉淀（IP）控制（即免疫前血清免疫沉淀）；用兔抗GFP血清进行GFP-PKCαRD+V3免疫沉淀。
图4。
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体外纯化的GST-PKCαRD与β1整合素胞质肽的直接关联。（A） 在体外下拉试验（如材料和方法所述）中，比较了GST-PKCαRD+V3、GST-PKCαRD、PKCαC1AC1B（aa32-156）或GST单独与β1整合素Cyto-2-和Cyto-3-肽GK的结合。对于每个样品，所有肽结合的GFP-PKCα（结合）与含有未结合蛋白（未结合）的相应上清液的五分之一一起运行。（B） GST-PKCαRD+V3与涂有GK的链霉亲和素-琼脂糖珠的结合，但不是其加扰等效物（scra）或无肽（no-peptide）对照物。（C） 谷胱甘肽珠上的GST-PKCαRD+V3未经处理（无肽[无肽]）或在4°C下与游离GK肽或其炒制等效物（scr）（1 mg/ml）预孵育1 h，用细胞提取缓冲液洗涤，然后与MCF-7或β1整合素缺失GD25细胞的细胞提取液翻滚。然后通过免疫印迹分析结合部分的β1整合素和GST-PKCα含量。
图5：。
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通过联合免疫沉淀人β1整合素/IL-2R-β1整合素嵌合体与PKCα在β1缺失的GD25细胞中的结合位点定位。（A） β1A整合素（用兔抗人β1整合素多克隆抗血清免疫沉淀）与GFP-PKCαWT、GFP-PKC-αRD+V3和GFP-PKC-αC2V3共沉淀，但不与GFP-PKCαΔ（V1-PS）RD或GFP-PKC/αRD共沉淀，如抗GFP抗体所检测。这些蛋白来自细胞表面生物素化的GD25细胞，GD25细胞与全长未标记的β1A整合素和各种GFP标记的PKCαRD结构共同转染。将蛋白质G珠上的所有结合蛋白（结合）和沉淀后第一次离心（未结合）后留在细胞提取上清液中的五分之一未结合蛋白装入。剥离含有抗整合素免疫沉淀物的印迹，并用抗β1整合素单克隆抗体重制；用HRP-共轭链霉亲和素探测一个类似制备的重复印迹。使用抗β1多克隆抗体免疫沉淀两种主要的生物素化表面蛋白，代表β1整合素α/β异二聚体（低带与抗β1整合素MAb检测到的β链结合）。显示了近似分子质量标记的位置。（B） 兔抗PKCα多克隆抗血清检测到IL-2R-WTβ1A整合素或其截短结构物（包含IL-2R的细胞外[EC]和跨膜[TM]结构域以及β1A的细胞内[IC]部分）与内源性PKCα共沉淀。这些蛋白来自转染IL-2R-β1A整合素（aa757-803、WT或aa757-796或aa757-284）嵌合物的GD25细胞。装载第一次离心后沉淀（unbound）后，蛋白G珠（bound）上的所有结合蛋白和细胞提取上清液中剩余的五分之一未结合蛋白。剥离印迹，并用HRP-结合链霉亲和素（Strep-HRP）重制。
图5：。
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通过联合免疫沉淀人β1整合素/IL-2R-β1整合素嵌合体与PKCα在β1缺失的GD25细胞中的结合位点定位。（A） β1A整合素（用兔抗人β1整合素多克隆抗血清免疫沉淀）与GFP-PKCαWT、GFP-PKC-αRD+V3和GFP-PKC-αC2V3共沉淀，但不与GFP-PKCαΔ（V1-PS）RD或GFP-PKC/αRD共沉淀，如抗GFP抗体所检测。这些蛋白来自细胞表面生物素化的GD25细胞，GD25细胞与全长未标记的β1A整合素和各种GFP标记的PKCαRD结构共同转染。将蛋白质G珠上的所有结合蛋白（结合）和沉淀后第一次离心（未结合）后留在细胞提取上清液中的五分之一未结合蛋白装入。剥离含有抗整合素免疫沉淀物的印迹，并用抗β1整合素MAb重新处理；用HRP-共轭链霉亲和素探测一个类似制备的重复印迹。使用抗β1多克隆抗体免疫沉淀两种主要的生物素化表面蛋白，代表β1整合素α/β异二聚体（低带与抗β1整合素MAb检测到的β链结合）。显示了近似分子质量标记的位置。（B） 兔抗PKCα多克隆抗血清检测到IL-2R-WTβ1A整合素或其截短结构物（包含IL-2R的细胞外[EC]和跨膜[TM]结构域以及β1A的细胞内[IC]部分）与内源性PKCα共沉淀。这些蛋白来自转染IL-2R-β1A整合素（aa757-803、WT或aa757-796或aa757-284）嵌合物的GD25细胞。装载第一次离心后沉淀（unbound）后，蛋白G珠（bound）上的所有结合蛋白和细胞提取上清液中剩余的五分之一未结合蛋白。剥离印迹，并用HRP-结合链霉亲和素（Strep-HRP）重制。
图6。
图6。
鉴定PKCα第三可变结构域（V3）内的12-氨基酸区域，以包含β1整合素的脂质依赖性结合位点和细胞定向运动的分子决定簇。（A） 各种PKCαRD+V3截断构造的示意图。（B） MCF-7细胞中表达的各种GFP标记的PKCαV3结构域截断结构体（在PS和TPA存在[+]和不存在[−]的情况下）：301（aa1-301）、313（aa1-313）、325（aa1-325）和337（aa1-337）与生物素化GK21肽之间的复合物形成，如图2B图例所示。（C） β1A整合素（免疫沉淀[IP]与兔抗人β1整合素多克隆抗血清）与PKCα325（aa1-325）和337（aa1-337）共沉淀，如抗GFP抗体所检测。这些蛋白质来自细胞表面生物素化的GD25细胞，GD25细胞与全长未标记的β1A整合素和上述GFP标记的PKCαV3结构域截短物共同转染。将蛋白质G珠上的所有结合蛋白（结合）和沉淀后第一次离心（未结合）后留在细胞提取上清液中的五分之一未结合蛋白装入。剥离含有抗整合素免疫沉淀物的印迹，并用HRP-结合链霉亲和素（Strep-HRP）进行复制。使用抗β1多克隆抗体，代表β1整合素α/β异二聚体，对两种主要的生物素化表面蛋白进行免疫沉淀，如图5A所示。显示了近似分子质量标记的位置。（D） 与GFP载体控制转染细胞相比，相同的PKCαV3结构域截断构造对朝向PDBu梯度的定向细胞运动的影响（使用不同的V3截断突变体重复图1中的实验）（参见图1A的图例）。
图6。
图6。
鉴定PKCα第三可变结构域（V3）内的12-氨基酸区域，以包含β1整合素的脂质依赖性结合位点和细胞定向运动的分子决定簇。（A） 各种PKCαRD+V3截断构造的示意图。（B） MCF-7细胞中表达的各种GFP标记的PKCαV3结构域截断结构体（在PS和TPA存在[+]和不存在[−]的情况下）：301（aa1-301）、313（aa1-313）、325（aa1-325）和337（aa1-337）与生物素化GK21肽之间的复合物形成，如图2B图例所示。（C） β1A整合素（免疫沉淀[IP]与兔抗人β1整合素多克隆抗血清）与PKCα325（aa1-325）和337（aa1-337）共沉淀，如抗GFP抗体所检测。这些蛋白质来自细胞表面生物素化的GD25细胞，GD25细胞与全长未标记的β1A整合素和上述GFP标记的PKCαV3结构域截短物共同转染。将蛋白质G珠上的所有结合蛋白（结合）和沉淀后第一次离心（未结合）后留在细胞提取上清液中的五分之一未结合蛋白装入。剥离含有抗整合素免疫沉淀物的印迹，并用HRP-结合链霉亲和素（Strep-HRP）进行复制。使用抗β1多克隆抗体免疫沉淀两种主要的生物素化表面蛋白，代表β1整合素α/β异二聚体，如图5A所示。显示了近似分子质量标记的位置。（D） 与GFP载体控制转染细胞相比，相同的PKCαV3结构域截断构造对朝向PDBu梯度的定向细胞运动的影响（使用不同的V3截断突变体重复图1中的实验）（参见图1A的图例）。
图7。
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细胞渗透型GK21对乳腺癌细胞趋化性的影响。（A） 在存在PS和TPA（+脂质）的情况下，全长GFP-PKCα与通过化学合成与触角第三螺旋（残基43至58）序列（GK21-ANT）串联而成的GK21肽结合，而不是其加扰版本（GK22-ANT加扰）或单独的触角序列（ANT）。对于每个样品，所有肽结合的GFP-PKCα（珠）与含有未结合蛋白的相应上清液（Sup）的五分之一一起运行。（B） 瞬时表达全长GFP-PKCα的MCF-7细胞在Dunn室中对PDBu梯度表现出显著的定向趋化性(P（P）< 0.001). 这种PKC驱动的定向运动通过用8μM的细胞渗透剂（触角足标记）、罗丹明形式的GK21（GK21-ANT）预处理细胞而消除，但不是其扰频版本。有关轨迹图的解释，请参见图1A的图例。（C） 未转染的MDA-MB-231细胞在Dunn室（外孔0.1μM，P（P）< 0.001). 通过用8μM的细胞渗透剂（触角足标记）、罗丹明形式的GK21（GK21-ANT）预处理细胞，但不是其扰序形式，消除了对EGF的趋化作用。
图7。
图7。
细胞渗透型GK21对乳腺癌细胞趋化性的影响。（A） 在存在PS和TPA（+脂质）的情况下，全长GFP-PKCα与通过化学合成与触角第三螺旋（残基43至58）序列（GK21-ANT）串联而成的GK21肽结合，而不是其加扰版本（GK22-ANT加扰）或单独的触角序列（ANT）。对于每个样品，所有肽结合的GFP-PKCα（珠）与含有未结合蛋白的相应上清液（Sup）的五分之一一起运行。（B） 瞬时表达全长GFP-PKCα的MCF-7细胞在Dunn室中对PDBu梯度表现出显著的定向趋化性(P（P）< 0.001). 用8μM的细胞发酵液（触角标记的）、罗丹明形式的GK21（GK21-ANT）预处理细胞，而不是其加扰版本，可以消除PKC驱动的定向运动。有关轨迹图的解释，请参见图1A的图例。（C） 未转染的MDA-MB-231细胞在Dunn室（外孔0.1μM，P（P）< 0.001). 通过用8μM的细胞发酵液（触角标记的）、罗丹明形式的GK21（GK21-ANT）预处理细胞，消除了对EGF的趋化作用，但不消除其打乱版本。
图8。
图8。
逆转录病毒转导编码GK21序列的小基因插入物可消除EGF诱导的趋化性。用来自Phoenix包装细胞的培养基感染MDA-MB231细胞，该培养基含有编码myc表位标记的GK21β1细胞质序列的完整逆转录病毒、其扰频等效物或单独的pBabe载体。使用平行培养物检查逆转录病毒转导效率，这些培养物用抗myc MAb 9E10固定并染色。感染后48小时，对231个细胞进行胰蛋白酶化，并进行8小时Transwell室迁移试验（如材料和方法所述）。细胞采集和计数由两人以盲法进行，随后由第三名研究人员对样本进行解码。大约10%和14%的未感染细胞在8小时的时间过程中分别通过过滤器向PDBu（A）和EGF（B）梯度迁移。在同一实验中，根据迁移的未感染细胞的平均百分比（设定为100%），对每次治疗后迁移的细胞群体百分比（低孔细胞计数/高孔细胞计数）进行标准化。所示为迁移至±标准偏差的细胞的平均百分比n个=每个处理3口井。结果代表了三个独立的实验。
图9：。
图9：。
通过TUNEL分析（Promega）评估引入仅编码pBABE载体、GK21或GK21乱序的逆转录病毒构建物对细胞存活的影响。阳性对照细胞与30μM染料木素孵育48小时。通过荧光激活细胞分选分析检测到的TdT介导的荧光素结合dUTP摄取量来监测细胞凋亡。M1表示在阴性截止值以上显示明显凋亡的细胞亚群，这是由在没有TdT的情况下加入的荧光素结合的dUTP的数量决定的。结果代表了两个独立的实验。
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引用人

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