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.2002年6月15日；16(12):1472-87.
doi:10.1101/gad.995802。

哺乳动物细胞大小由mTOR及其下游靶点S6K1和4EBP1/eIF4E控制

黛安·芬加 1, 索菲·萨拉马, 克里斯蒂娜·邹, 埃德·哈洛, 约翰·布莱尼斯
附属公司

哺乳动物细胞大小由mTOR及其下游靶点S6K1和4EBP1/eIF4E控制

黛安·芬加等。 基因开发. .

摘要

细胞周期进程和细胞生长的协调作用（细胞大小和细胞质量的增加）对持续的细胞增殖至关重要，然而控制细胞生长的生化信号尚不明确，尤其是在哺乳动物系统中。我们发现哺乳动物细胞中的细胞生长和细胞周期进程是可分离的过程，细胞生长到适当的细胞大小需要依赖mTOR和PI3K的信号。mTOR的雷帕霉素耐药突变体的表达以激酶依赖性的方式挽救了雷帕霉素诱导的细胞大小减少表型，显示了mTOR在控制细胞生长中的进化保守作用。具有部分雷帕霉素抵抗活性或eIF4E过表达的S6K1突变体的表达可单独或部分地挽救雷帕霉素诱导的细胞尺寸减小。在没有雷帕霉素的情况下，S6K1或eIF4E的过度表达会增加细胞大小，当共同表达时，它们会合作进一步增加细胞大小。4EBP1磷酸化位点缺陷突变体的表达构成性结合eIF4E-Cap复合物以抑制翻译起始，从而减小细胞大小并阻止eIF4E对细胞大小的影响。这些数据表明，mTOR信号下游至至少两个独立靶点，即S6K1和4EBP1/eIF4E，它们在翻译控制中起作用，以调节哺乳动物细胞大小。

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数字

图1
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当细胞周期进展受阻时，mTOR和PI3K介导的细胞生长继续。(一)将培养在DMEM/10%FBS中的大鼠1a成纤维细胞与细胞表面标记物CD20（2μg）和编码各种pRb途径细胞周期抑制蛋白（p16、p21、pRb 328–392和cdk2 dn；20μg）的质粒瞬时共转染。转染后48小时，收集细胞进行流式细胞术分析，以测定DNA含量和G的平均FSC-h1-相细胞。(B类)Rat.1a RT16.15细胞在四环素（+Tet；p16 Off）存在下培养。为了诱导p16表达，从RT16.15细胞系中去除四环素24–48小时（−Tet；p16 On）。然后裂解细胞并用抗p16抗体进行免疫印迹（24小时），或收获细胞进行流式细胞术分析，以确定G的DNA含量和平均FSC-h1-相细胞（48小时）。(C类)大鼠1a RT16.15细胞在四环素（p16 Off）存在下被剥夺血清48小时，然后用药物抑制剂雷帕霉素（50 ng/mL）或LY294002（50μM）预处理30分钟。然后，在没有或存在药物抑制剂的情况下，将细胞转移到缺乏四环素的DMEM/10%FBS（p16 On）。48小时后，收集细胞进行流式细胞术分析，以确定G的平均FSC-h1-相细胞。指示了每个直方图曲线的平均FSC-H值。雷帕霉素和LY294002通过SDS-PAGE上的流动性测定抑制S6K1的活性（数据未显示）。
图1
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当细胞周期进展受阻时，mTOR和PI3K介导的细胞生长继续。(一)将培养在DMEM/10%FBS中的大鼠1a成纤维细胞与细胞表面标记物CD20（2μg）和编码各种pRb途径细胞周期抑制蛋白（p16、p21、pRb 328–392和cdk2 dn；20μg）的质粒瞬时共转染。转染后48小时，收集细胞进行流式细胞术分析，以测定DNA含量和G的平均FSC-h1-相细胞。(B类)Rat.1a RT16.15细胞在四环素（+Tet；p16 Off）存在下培养。为了诱导p16表达，从RT16.15细胞系中去除四环素24–48小时（−Tet；p16 On）。然后裂解细胞并用抗p16抗体进行免疫印迹（24小时），或收获细胞进行流式细胞术分析，以确定G的DNA含量和平均FSC-h1-相细胞（48小时）。(C类)大鼠1a RT16.15细胞在四环素（p16 Off）存在下被剥夺血清48小时，然后用药物抑制剂雷帕霉素（50 ng/mL）或LY294002（50μM）预处理30分钟。然后，在没有或存在药物抑制剂的情况下，将细胞转移到缺乏四环素的DMEM/10%FBS（p16 On）。48小时后，收集细胞进行流式细胞术分析，以确定G的平均FSC-h1-相细胞。显示了每个直方图曲线的平均FSC-H值。雷帕霉素和LY294002通过SDS-PAGE上的流动性测定抑制S6K1的活性（数据未显示）。
图2
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雷帕霉素和LY294002治疗周期性U2OS细胞可减小细胞大小并抑制增殖和细胞周期进展。(A、 B类)将培养在DMEM/10%FBS中的U2OS细胞在没有（−Rapa；乙醇载体）或有（+Rapa）雷帕霉素（20 ng/mL）或没有（−LY；DMSO载体）或存在（+LY）LY294002（50μM）的情况下培养72小时1-相位单元如所示一，而三份样品的定量如所示B类. *P（P） < 与车辆控制相比为0.002。FSC-H+Rapa/−Rapa的平均比率显示在每个+Rapa bar的上方。(C类)U2OS细胞在1×10的条件下培养4细胞/孔，在没有或存在雷帕霉素（rapa）或LY294002（LY）的情况下培养，药物治疗2天和4天后，在血细胞仪中计数。(D类)细胞的DNA含量直方图，如一. (E类)U2OS细胞在无雷帕霉素或LY294002（−）或有雷帕霉素（+）的条件下孵育72 h，测定内源性S6K1对GST-S6的体外激酶活性；测定了等量的蛋白质(上面的). 用m培养相同的总蛋白7GTP-琼脂糖珠或蛋白A-琼脂酶珠作为阴性对照，eIF4E和4EBP1的量结合到m7显示乙醇载体（−）或雷帕霉素（+）处理72小时后的GTP–Cap复合物(降低). 4EBP1的α-、β-和γ-亚型用箭头表示：α带代表低磷酸化形式，γ带代表高磷酸化形式。但β带代表中间磷酸化状态。(F类)S和G的平均FSC-H2/M期细胞如图所示（与一). *P（P） < 0.002, **P（P） < 0.02, ***P（P） = 0.08与−Rapa条件。(G公司)在不含雷帕霉素20 ng/mL（−Rapa；黑条）或存在雷帕霉素（+Rapa；灰条）的DMEM/10%FBS中培养72 h的细胞进行胰蛋白酶化并计数。对等量的细胞进行裂解，并进行蛋白质分析以确定总细胞蛋白质含量+/-S.E(H（H）)将U2OS、293或HeLa细胞的三重平板在没有（−）或存在（+）雷帕霉素的情况下培养72小时。显示了处理细胞的平均FSC-h与+Rapa/−Rapa+/−S.E.的比率。车辆处理单元的相对单元大小设置为1.0。
图2
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雷帕霉素和LY294002治疗周期性U2OS细胞可减小细胞大小并抑制增殖和细胞周期进展。(A、 B类)在DMEM/10%FBS中培养的U2OS细胞在不存在（−Rapa；乙醇载体）或存在（+Rapa）雷帕霉素（20 ng/mL）或不存在（−LY；DMSO载体）或存在（+LY）LY294002（50μM）的条件下孵育72小时1-相位单元如所示一，而三份样品的定量如所示B类. *P（P） < 与车辆控制相比为0.002。FSC-H+Rapa/−Rapa的平均比率显示在每个+Rapa bar的上方。(C类)U2OS细胞在1×10的条件下培养4细胞/孔，在没有或存在雷帕霉素（rapa）或LY294002（LY）的情况下培养，药物治疗2天和4天后，在血细胞仪中计数。(D类)细胞的DNA含量直方图，如一. (E类)U2OS细胞在无雷帕霉素或LY294002（−）或有雷帕霉素（+）的条件下孵育72 h，测定内源性S6K1对GST-S6的体外激酶活性；测定了等量的蛋白质(上面的). 用m培养相同的总蛋白7GTP-琼脂糖珠或蛋白A-琼脂酶珠作为阴性对照，eIF4E和4EBP1的量结合到m7GTP–显示乙醇载体（−）或雷帕霉素（+）处理72小时后的盖复合物(降低). 4EBP1的α-、β-和γ-亚型用箭头表示：α带代表低磷酸化形式，γ带代表高磷酸化形式。但β带代表中间磷酸化状态。(F类)S和G的平均FSC-H2/M期细胞如图所示（与一). *P（P） < 0.002, **P（P） < 0.02, ***P（P） = 0.08与−Rapa条件。(G公司)在不含雷帕霉素20 ng/mL（−Rapa；黑条）或存在雷帕霉素（+Rapa；灰条）的DMEM/10%FBS中培养72 h的细胞进行胰蛋白酶化并计数。对等量的细胞进行裂解，并进行蛋白质分析以确定总细胞蛋白质含量+/-S.E(H（H）)U2OS、293或HeLa细胞的三层平板在不存在（−）或存在（+）雷帕霉素的情况下孵育72小时。显示了经处理的细胞的平均FSC-h与Rapa/−Rapa+/−S.E.的比率。车辆处理单元的相对单元大小设置为1.0。
图3
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雷帕霉素耐药（RR）mTOR可挽救雷帕霉素抑制的下游生化信号传导和雷帕霉素诱导的细胞尺寸减小。(一)用pcDNA3载体对照或AU1标记的mTOR构建体（5μg）和HA标记的4EBP1（0.5μg）瞬时转染在DMEM/FBS中培养的U2OS细胞。如图所示，将转染细胞在没有（−）或有（+）雷帕霉素（20 ng/mL）的情况下培养20 h，然后进行裂解，在SDS-PAGE上进行解析，并用抗磷酸-S6、抗HA、抗AU1或抗MAPK抗体进行免疫印迹（IB），作为负载控制。(B类)用pcDNA3载体控制或一组mTOR质粒（10μg）加CD20（1μg）瞬时转染细胞。在没有雷帕霉素（20 ng/mL）（−Rapa；黑色曲线）或存在（+Rapa；灰色曲线）的情况下，将每个转染的平板分成两个含有DMEM/FBS的平板，持续72小时。按照材料和方法中的描述，收集细胞以通过流式细胞术进行分析，G的平均FSC-h1-测定FITC+期细胞数。显示了每个直方图曲线对应的平均FSC-H值。(C类)如中所示B类，除了显示了三次转染的定量。FSC-H+Rapa/−Rapa的平均比率显示在每个+Rapa条上。（NS）不重要。(D类)用1μg HA标记的S6K1共转染细胞(左边面板）或1μg HA-标签4EBP1(正确的与10μg AU1标记的mTOR构建物一起培养，培养结果与细胞大小实验相同。如图所示，将转染细胞在没有（−）或有（+）雷帕霉素的情况下培养72小时，并通过抗HA-S6K1体外激酶分析或免疫印迹分析。
图3
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雷帕霉素耐药（RR）mTOR可挽救雷帕霉素抑制的下游生化信号传导和雷帕霉素诱导的细胞尺寸减小。(一)在DMEM/FBS中培养的U2OS细胞瞬时转染pcDNA3载体控制或AU1-标记的mTOR构建物（5μg）和HA-标记的4EBP1（0.5μg）。如图所示，将转染细胞在没有（−）或有（+）雷帕霉素（20 ng/mL）的情况下培养20 h，然后进行裂解，在SDS-PAGE上进行解析，并用抗磷酸-S6、抗HA、抗AU1或抗MAPK抗体进行免疫印迹（IB），作为负载控制。(B类)用pcDNA3载体控制或一组mTOR质粒（10μg）加CD20（1μg）瞬时转染细胞。在没有雷帕霉素（20 ng/mL）（−Rapa；黑色曲线）或存在（+Rapa；灰色曲线）的情况下，将每个转染的平板分成两个含有DMEM/FBS的平板，持续72小时。按照材料和方法中的描述，收集细胞以通过流式细胞术进行分析，G的平均FSC-h1-测定FITC+期细胞数。显示了每个直方图曲线对应的平均FSC-H值。(C类)如中所示B类，除了显示了三次转染的定量。FSC-H+Rapa/−Rapa的平均比率显示在每个+Rapa条上。（NS）不重要。(D类)用1μg HA标记的S6K1共同转染细胞(左边面板）或1μg HA-标签4EBP1(正确的与10μg AU1标记的mTOR构建物一起培养，培养结果与细胞大小实验相同。如图所示，将转染细胞在没有（−）或有（+）雷帕霉素的情况下培养72小时，并通过抗HA-S6K1体外激酶分析或免疫印迹分析。
图3
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雷帕霉素抗性（RR）mTOR拯救雷帕霉素抑制的下游生物化学信号传导和雷帕霉素诱导的细胞大小减小。(一)在DMEM/FBS中培养的U2OS细胞瞬时转染pcDNA3载体控制或AU1-标记的mTOR构建物（5μg）和HA-标记的4EBP1（0.5μg）。如图所示，将转染细胞在没有（−）或有（+）雷帕霉素（20 ng/mL）的情况下培养20 h，然后进行裂解，在SDS-PAGE上进行解析，并用抗磷酸-S6、抗HA、抗AU1或抗MAPK抗体进行免疫印迹（IB），作为负载控制。(B类)用pcDNA3载体控制或一组mTOR质粒（10μg）加CD20（1μg）瞬时转染细胞。在没有雷帕霉素（20 ng/mL）（−Rapa；黑色曲线）或存在（+Rapa；灰色曲线）的情况下，将每个转染的平板分成两个含有DMEM/FBS的平板，持续72小时。按照材料和方法中的描述，收集细胞以通过流式细胞术进行分析，G的平均FSC-h1-测定了FITC+期细胞群。显示了每个直方图曲线对应的平均FSC-H值。(C类)如中所示B类，除了显示了三次转染的定量。FSC-H+Rapa/−Rapa的平均比率显示在每个+Rapa条上。（NS）不重要。(D类)用1μg HA标记的S6K1共同转染细胞(左边面板）或1μg HA-标签4EBP1(正确的与10μg AU1标记的mTOR构建物一起培养，培养结果与细胞大小实验相同。如图所示，将转染细胞在没有（−）或有（+）雷帕霉素的情况下培养72小时，并通过抗HA-S6K1体外激酶分析或免疫印迹分析。
图4
图4
雷帕霉素耐药（RR）S6K1s部分挽救了雷帕霉素抑制的下游信号传导，部分挽救了由雷帕霉素诱导的细胞尺寸减小。(一)用pRK7载体控制或HA标记的S6K1构建物（5μg）瞬时转染U2OS细胞，在没有（−）或有（+）雷帕霉素（20 ng/mL）的情况下孵育20 h，溶解，在SDS-PAGE上溶解，并用抗HA、抗磷酸-S6或抗MAPK抗体进行免疫印迹（IB），作为负荷控制，如图所示。用αHA抗体免疫沉淀等量蛋白，并测定HA-S6K1的体外激酶活性。(B类)用pRK7载体控制或一组S6K1质粒（10μg）加CD20（1μg）共同转染细胞。将每个转染的平板分成两个含有DMEM/FBS的平板，在没有雷帕霉素（20 ng/mL）（−Rapa；白条）或有雷帕霉素的（+Rapa；黑条）中培养72小时，并采集用于流式细胞仪分析。对于−Rapa治疗，G的平均FSC-H1-显示单个转染的FITC+期细胞群；对于+Rapa处理，显示了三次转染+/-S.E.的平均FSC-H*P（P） < 与矢量控制+Rapa相比为0.02。(C类)用HA标记的S6K1（10μg）转染细胞，并进行与细胞大小实验相同的培养。将转染细胞在没有（−）或有（+）雷帕霉素的情况下孵育72 h，并通过抗HA-S6K1免疫印迹或体外激酶分析或如图所示进行分析。
图5
图5
eIF4E的过度表达以依赖于Cap依赖性翻译的方式部分挽救了雷帕霉素诱导的细胞大小减少，eIF4E和RR-S6K1的共同表达协同提供了更强的挽救。(一)将U2OS细胞与pMV7载体控制或eIF4E（10μg）与CD20（1μg）共转染，在没有（−）或存在（+）雷帕霉素的情况下培养72 h，并通过流式细胞仪分析以确定细胞大小。G的平均FSC-H+/-S.E1-显示了来自四重转染的FITC+期细胞群*P（P） < 与病媒控制+Rapa相比为0.03。(B类)用所示的质粒组合（8μg pMV7或pMV7/eIF4E+2μg pACTAG2或pACT/AA-4EBP1）和CD20（1μg）转染细胞，并在雷帕霉素存在下培养72 h，然后用流式细胞仪测定细胞大小，如上所述。(C类)用所示的质粒组合（5μg+5μg）和CD20（1μg）共同转染细胞，并在没有（−）或有（+）雷帕霉素的情况下培养72 h，然后用流式细胞仪测定细胞大小，如上所述。对于−Rapa治疗，显示了单个转染的平均FSC-H；对于+Rapa处理，显示了三次转染+/−S.E.的平均FSC-H。+Rapa处理细胞之间的统计比较用括号表示。
图6
图6
S6K1或eIF4E的过度表达分别增加了细胞大小，S6K1和eIF4E的共同表达协同进一步增加细胞大小，4EBP1显性突变的过度表达降低了细胞大小。帽依赖性翻译可能介导eIF4E和4EBP1对细胞大小的影响。(一)将U2OS细胞与CD20（1μg）加pRK7载体控制、野生型（WT）或激酶死亡（KD）S6K1构建物（10μg）瞬时共转染，在DMEM/FBS中培养72 h，并通过流式细胞仪测定细胞大小。G的平均FSC-H+/-S.E1-测定FITC+期细胞数。WT条来自两个独立转染的四份样本；pRK7和KD条来自三个独立转染的五个样本。统计比较用括号表示。免疫印迹（插图）显示了转染的HA-S6K1s在本实验中的等效表达。(B类)用所示质粒（10μg）和CD20（1μg）共同转染细胞，如上所述，测定三次转染FITC+细胞群的平均FSC-H+/-S.E*P（P） < 0.05与病媒控制。(C类)如上所述，显示了用所示质粒（8μg pMV7或pMV7/eIF4E+2μg pACTAG2或pACT/AA-4EBP1）加CD20（1μg）单次转染的平均FSC-H。(D类)用所示的质粒组合（5μg+5μg）和CD20（1μg）共同转染细胞，三份样品的平均FSC-H+/-S.E.如上所示。统计比较用括号表示。虽然P（P）-S6K1+pMV7与S6K1+eIF4E的比较值(P（P） = 0.06）刚好超出我们定义的统计显著性值(P（P） < 0.05），我们在许多实验中一致观察到，S6K1+eIF4E联合转染导致的细胞大小大于单独的S6K1。(E类)用所示质粒（10μg）和CD20（1μg）共同转染细胞，三次转染FITC+细胞的平均FSC-H+/-S.E.如上图所示。统计比较用括号表示。(F类)同等数量的蛋白质（转染细胞与E类)通过SDS-PAGE进行解析，并通过抗HA-4EBP1免疫印迹进行分析(上面的)或与m一起孵化7GTP-sepharose珠，以及与珠结合的内源性eIF4E和转染的HA-4EBP1的量(降低).
图6
图6
S6K1或eIF4E的过度表达分别增加了细胞大小，S6K1和eIF4E的共同表达协同进一步增加细胞大小，4EBP1显性突变的过度表达降低了细胞大小。Cap-dependent转换可能会调节eIF4E和4EBP1对细胞大小的影响。(一)将U2OS细胞与CD20（1μg）加pRK7载体控制、野生型（WT）或激酶死亡（KD）S6K1构建物（10μg）瞬时共转染，在DMEM/FBS中培养72 h，并通过流式细胞仪测定细胞大小。G的平均FSC-H+/−S.E1-测定FITC+期细胞数。WT条来自两个独立转染的四份样本；pRK7和KD条来自三个独立转染的五个样本。统计比较用括号表示。本实验中转染的HA-S6K1s的等效表达通过免疫印迹显示（插图）。(B类)用所示质粒（10μg）和CD20（1μg）共同转染细胞，如上所述，测定三次转染FITC+细胞群的平均FSC-H+/-S.E*P（P） < 0.05与载体对照相比。(C类)如上所示，使用所示质粒（8μg pMV7或pMV7/eIF4E+2μg pACTAG2或pACT/AA-4EBP1）和CD20（1μg）进行单次转染的平均FSC-H。(D类)用所示的质粒组合（5μg+5μg）和CD20（1μg）共同转染细胞，三份样品的平均FSC-H+/-S.E.如上所示。统计比较用括号表示。虽然P（P）-S6K1+pMV7与S6K1+eIF4E的比较值(P（P） = 0.06）刚好超出我们定义的统计显著性值(P（P） < 0.05），我们在许多实验中一致观察到，S6K1+eIF4E联合转染导致的细胞大小大于单独的S6K1。(E类)用所示质粒（10μg）和CD20（1μg）共同转染细胞，三次转染FITC+细胞的平均FSC-H+/-S.E.如上图所示。统计比较用括号表示。(F类)同等数量的蛋白质（转染细胞与E类)通过SDS-PAGE进行解析，并通过抗HA-4EBP1免疫印迹进行分析(上面的)或与m一起孵化7GTP琼脂糖凝胶珠，以及与珠结合的内源性eIF4E和转染的HA-4EBP1的量(降低).
图7
图7
模型描述了mTOR信号通过其下游靶点S6K1和4EBP1/eIF4E在细胞大小控制中的作用。营养和有丝分裂原依赖性信号可能通过mTOR和PI3K依赖性信号的协同作用调节细胞生长和细胞大小，以响应细胞外条件。尽管为了简单起见，此模型中未显示Akt（PKB），但它是PI3K下游细胞大小的重要调节器。尽管有报道称Akt（PKB）可向S6K1、4EBP1和mTOR发出信号，但Akt与这些信号分子的确切关系尚不清楚。
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