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.2002年7月；22(14):5222-34.
doi:10.1128/MCB.22.14.5222-5234.2002。

PIAS蛋白作为SUMO-1连接酶调节转录因子

努拉·科塔亚 1, 乌拉·卡沃宁, 奥利·A·Jänne, 乔尔马·J·帕尔维莫
附属公司

PIAS蛋白作为SUMO-1连接酶调节转录因子

努拉·科塔贾等。 分子细胞生物学. 2002年7月.

摘要

PIAS（活化STAT蛋白抑制剂）蛋白与各种转录因子的活性相互作用并调节其活性。在这项工作中，我们证明了PIAS蛋白xalpha、xbeta、1和3与小泛素相关修饰物SUMO-1及其E2结合酶Ubc9相互作用，并且PIAS蛋白本身被SUMO-1（sumoylated）共价修饰。PIAS蛋白也以非共价的方式系住其他sumoylated蛋白。此外，重组PIASxalpha在体外增强Ubc9介导的雄激素受体和c-Jun的sumoylation。重要的是，PIAS蛋白在促进完整细胞中琥珀酰化的能力上存在差异。刺激蛋白sumoylation的能力以及与sumoylated蛋白的相互作用依赖于保守的PIAS环指状结构域。这些功能与PIASxalpha对雄激素受体依赖性转录的活性有关。总之，我们的结果表明PIAS蛋白作为SUMO-1-系留蛋白和锌指依赖的E3 SUMO蛋白连接酶发挥作用，这些特性可能解释了它们调节各种转录因子活性的能力。

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图1。
图1。
PIAS蛋白在体外与SUMO-1和Ubc9相互作用。ARIP3、ARIP3Δ347-418、ARIP1Δ467-487、Miz1、PIAS1和PIAS3标记为[35S] 通过体外翻译蛋氨酸，并与谷胱甘肽-脑结合GST、GST-SUMO-1或GST-Ubc9孵育。在大量洗涤后，用SDS样品缓冲液洗脱结合蛋白，用SDS-10%PAGE进行解析，并通过荧光成像进行可视化。通道i，输入样本代表与基质孵育的标记蛋白质数量的10%。
图2。
图2。
PIAS蛋白和SUMO-1在COS-1细胞中的定位。按照材料和方法中的描述，用编码FLAG-ARIP3、FLAG-ARIP 3Δ347-418、FLAG-AR IP3Δ467-487、FLAG-PIAS1、FLAG-PAAS3、FLAH-Miz1或EGFP-SUMO-1的表达质粒转染细胞。用针对FLAG表位的M2抗体和罗丹明红X偶联二级抗体（a至F）进行免疫荧光标记。使用连接至蔡司Axiover 135 M显微镜的Bio-Read MRC-1024共焦激光扫描系统对细胞进行分析。EGFP在488nm激发，罗丹明红X在568nm激发。
图3。
图3。
PIAS蛋白和SUMO-1在核颗粒中共定位。COS-1细胞与编码EGFP-SUMO-1和FLAG-ARIP3、FLAG-ARIP3Δ347-418、FLAG-ARIP3Δ467-487、FLAG-PIAS1、FLAG-PAAS3或FLAG-Miz1的表达质粒共转染。使用针对FLAG表位的M2抗体和罗丹明结合的二级抗体进行免疫荧光标记，并按照图2所示对细胞进行分析。分别收集图像（EGFP在488 nm处激发，而利萨明-罗丹明结合的M2抗鼠IgG在568 nm处兴奋），并按图所示进行合并。
图4。
图4。
SUMO-1在哺乳动物细胞和体外修饰ARIP3和其他PIAS蛋白。（A） 用1μg的pFLAG-ARIP3、pFLAG-Miz1、pFLAG-PIAS1或pFLAG-PIAS3和1.5μg的空pSG5载体或pSG5-His-SUMO-1转染生长在6-cm直径培养皿上的COS-1细胞。转染48小时后，将细胞溶解在含有10 mM NEM的RIPA-1缓冲液中，并用M2 FLAG抗体对细胞溶解液进行免疫印迹。（B） 体外PIAS蛋白的氨酰化。在vitro-translated中，35S标记的PIAS蛋白与纯化的GST-SUMO孵育GG公司-如图所示，GST-SAE1、GST-SAE2和GST-Ubc9存在（+）或不存在（-）时为1。通过添加SDS-PAGE样品缓冲液停止反应，并通过SDS-PAGE对样品进行解析并进行荧光照相。（C） 在B组所述的条件下，纯化GST-ARIP3、GST-ARIP3Δ347-418和GST-ARIPΔ467-487（各1μg）的氨酰化。用抗ARIP3抗体对反应混合物进行免疫印迹。
图5：。
图5：。
ARIP3与其他sumoylated蛋白相互作用。用1μg空pFLAG-CMV2或pFLAG-ARIP3和1.5μg空的pSG5或pSG5-His-SUMO-1转染COS-1细胞。转染48小时后，收集细胞并在含有10 mM NEM的RIPA-1缓冲液中或在含有2%SDS的变性缓冲液中溶解10 mM Tris-HCl（pH 8.0）-150 mM NaCl。在后一种缓冲液中溶解的样品在95°C下加热10分钟。在免疫沉淀（IP）之前，用10 mM Tris-HCl（pH 8.0）和150 mM NaCl（含1%Triton X-100）的混合物将这些样品稀释（1:10）。5%的细胞提取物用抗FLAG抗体（A）免疫印迹，其余样品用抗FLAG抗体免疫沉淀，然后用抗SUMO-1抗体（B）或抗FLAG免疫印迹（C）。WB，Western blotting。
图6。
图6。
ARIP3的锌指区是其他sumoylated蛋白招募所必需的。（A） 如图4所示，在COS-1细胞中不含或含有pSG5-His-SUMO-1的情况下，FLAG标记的野生型ARIP3、ARIP3Δ347-418、ARIP1Δ467-487和ARIP3△346-475共表达。在RIPA-1缓冲液中裂解细胞，并用抗FLAG抗体对裂解液中的样品进行免疫印迹。（B） 将编码EGFP、EGFP-ARIP3（341-418）或EGFP-ARIP3（34.1-490）的表达载体共转染到COS-1细胞中，不含或含pSG5-His-SUMO-1。在RIPA-1缓冲液中裂解细胞，并用抗GFP的抗体对裂解物进行免疫印迹。（C） A组的其余裂解物用抗FLAG抗体进行免疫沉淀（IP），免疫沉淀用抗SUMO-1抗体进行免疫印迹。（D） B组的其余裂解物用抗GFP抗体进行免疫沉淀，免疫沉淀用抗SUMO-1抗体进行免疫印迹。WB，Western blotting。
图7。
图7。
ARIP3结构域在与AR相互作用中的作用以及ARIP3对蛋白质sumoylation的影响。（A） 将0.7μg空pFLAG-CMV2载体或pFLAG-ARIP3、0.9μg pSG5或pSG5-rAR和0.9μg/pSG5或者pSG5-His-SUMO-1转染生长在6-cm直径平板上的COS-1细胞。转染24小时后向细胞提供100 nM睾酮，转染48小时后收集细胞，并在NEM存在（+）或不存在（-）的情况下在RIPA-2缓冲液中溶解。5%的裂解物用抗AR的K333抗体进行免疫印迹，其余样品用抗FLAG抗体进行免疫沉淀（IP）。免疫沉淀用抗AR抗体印迹。WB，Western blotting。（B） ARIP3的锌指区是NEM依赖性与AR相互作用所必需的。在COS-1细胞中，具有不同缺失的FLAG标记ARIP3与AR共表达。在含有10mM NEM的RIPA-2缓冲液中裂解细胞，并如图A所述进行细胞提取物的免疫印迹和免疫沉淀。箭头指示AR的sumoyled形式。（C）ARIP3的过表达增强内源性COS-1细胞蛋白的sumoyled。ARIP3、ARIP3Δ347-418或ARIP3△467-487在COS-1细胞中无SUMO-1或与SUMO-1共表达。细胞在RIPA-1缓冲液中裂解，裂解产物用抗SUMO-1抗体进行免疫印迹。wt，野生型。
图8。
图8。
ARIP3和PIAS1增强HeLa细胞AR的sumoylation。接种在六孔板上的HeLa细胞与100 ng pcDNA-Flag-hAR共转染；100 ng pFLAG-CMV2、pFLAG-ARIP3或pFLAG-PIAS1；和0、10或50 ng pSG5-His-SUMO-1。细胞在RIPA-1缓冲液中裂解，裂解产物用抗AR抗体进行免疫印迹。与内源性SUMO-1酰化的AR型与外源性表达的SUMO-1的AR型迁移之间的差异是由于SUMO-1表达载体中存在His标签。通过免疫印迹抗AR抗体-免疫沉淀AR和抗SUMO-1抗体（未显示）来验证sumoylated AR形式的身份。
图9：。
图9：。
ARIP3在体外增强AR和c-Jun的酰化。（A） ARIP3对体外翻译AR的sumoylation的影响。35S标记的体外翻译AR与纯化的GST-SUMO孵育GG公司-1（在所有反应中）、GST-SAE1加上GST-SAE2（在所有的反应中）和GST-Ubc9（在有或无GST、GST-ARIP3或GST-ARIPΔ347-418的情况下），如图所示。样品通过SDS-PAGE进行解析，并进行荧光照相。（B） ARIP3增强纯化重组c-Jun的sumoylation。His-tagged c-Jun与GST-SUMO孵育GG公司-1、GST-SAE1加上GST-SAE2和GST-Ubc9（仅存在GST）、GST-ARIP3、GST-ARIP3Δ347-418、GST-AR IP3（W383A）或GST-ARIPΔ467-487，如图所示。样品通过SDS-PAGE进行分离，并用抗-His抗体进行免疫印迹。箭头表示蛋白质的酰化形式。
图10。
图10。
PIAS蛋白增强GRIP1的sumoylation。将0.7μg空pFLAG-CMV2载体或编码FLAG-标记PIAS蛋白的载体、0.9μg pSG5或pSG5-GRIP1以及0.9μgpSG5和pSG5-His-SUMO-1转染生长在6-cm直径平板上的COS-1细胞。转染48小时后收集细胞，并在含有10 mM NEM的RIPA-2缓冲液中溶解。5%的裂解物用抗GRIP1抗体（A）免疫印迹，其余的用抗FLAG抗体免疫沉淀（IP），然后用抗GRIP抗体（B）免疫印记。WB，Western blotting。（C） 通过用抗FLAG抗体免疫印迹细胞裂解物来验证PIAS蛋白的数量。（D） 预测的PIAS1锌结合区是刺激GRIP1的sumoylation所必需的。COS-1细胞与0.9μg pSG5-GRIP1共转染；0.7μg pFLAG-CMV2、pFLAG-PIAS1、pFLAG-PIAS1（W372A）或pFLAG-PAAS1Δ310-407；和0.9μg pSG5或pSG5-His-SUMO-1。细胞在RIPA-2缓冲液中裂解，裂解产物用抗GRIP1抗体或抗FLAG抗体进行免疫印迹。
图11：。
图11：。
SUMO-1-系留区和连接酶结构域对PIAS蛋白协同调节AR依赖性转录的能力至关重要。将培养在12孔板上的HeLa（A）和COS-1细胞（B）与200 ng pARE共转染2TATA-LUC、20 ng pCMVβ、5 ng pcDNA Flag-hAR和10、50或100 ng pFLAG-ARIP3、pFLAG-ARIP3（W383A）或pFLAG-ARIP3Δ467-487，并用100 nM睾酮（T）处理或不处理。通过使用β-半乳糖苷酶活性对转染效率进行归一化后，报告基因活性相对于不含协调剂的AR+T表达（设为100）。wt，野生型。（C） 与B组相同的实验，但不是ARIP3表达质粒，COS-1细胞与pFLAG-PIAS1、pFLAG-PAAS1（W372A）或pFLAG-P1AS1Δ310-407共同转染。（D和E）与野生型AR相比，共转染ARIP3对SUMO-1附着赖氨酸突变为精氨酸的AR突变体[AR（K→R）]的影响。实验条件与面板A和B中的条件相同。数值表示三到六个独立实验的平均值±标准差。
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