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.2002年6月；129（11）：2619-28。
doi:10.1242/dev.129.11.2619。

锌指转录因子Klf4是结肠杯状细胞终末分化所必需的

乔纳森·P·卡茨 1, 纳塔莉·佩雷奥, 布里·戈德斯坦, 凯瑟琳·S·李, 帕特里夏·A·拉波斯基, 文森特·W·杨, 克劳斯·凯斯特纳
附属公司

锌指转录因子Klf4是结肠杯状细胞终末分化所必需的

乔纳森·P·卡茨等。 开发. 2002年6月.

摘要

Klf4（前身为GKLF）是一种锌指转录因子，在皮肤、肺部、胃肠道和其他几个器官的上皮细胞中表达。体外研究表明，Klf4在细胞增殖和/或分化中起着重要作用。Klf4缺失突变的纯合小鼠在出生后15小时内死亡，并表现出表皮晚期分化结构的选择性扰动，但Klf4在胃肠道的功能尚未研究。为了解决这个问题，我们在胚胎干细胞中通过同源重组产生了Klf4（-/-）小鼠。在这项研究中，我们提供了第一个体内证据，证明Klf4是结肠中的杯状细胞特异性分化因子。出生后第1天，Klf4（-/-）小鼠在结肠中表现出正常的细胞增殖和细胞死亡率。然而，Klf4（-/-）小鼠结肠中杯状细胞的数量减少了90%，原位杂交显示杯状细胞特异性标记物Muc2异常表达，结肠上皮Alcian Blue酸性粘蛋白染色异常，超微结构分析缺乏正常的杯状细胞形态。所有其他上皮细胞类型均存在于Klf4（-/-）小鼠的结肠中。总之，Klf4在体内结肠上皮细胞分化中起着关键作用。

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数字

图1
图1
靶向策略和原位杂交Klf4公司（A）用于基因靶向的四个等位基因Klf4公司显示了Southern blot分析中使用的限制性片段的预测带大小。外显子2和3的缺失导致外显子4的框架移位。外显子1仅编码Klf4公司蛋白质。将靶向载体外部的400 bp片段用作Southern blot探针。白色箭头表示PCR引物的位置。（B） Southern杂交显示野生型和靶向型Klf4公司乐队。（C） PCR筛查Klf4公司揭示了172bp的野生型、296bp的游离带和425bp的空带。（D，E）原位杂交Klf4公司出生后第1天小鼠的结肠中。（D） 野生型小鼠表现出Klf4公司mRNA（箭头）遍布上皮。（E）Klf4公司−/−小鼠没有表现出Klf4公司mRNA，确认成功删除Klf4公司.E、，生态RI；X、，Xba公司一、。
图2
图2
（A，B）BrdU免疫组织化学，显示出生后第1天小鼠结肠上皮细胞分裂。Klf4公司−/−小鼠（B）与野生型（A）同窝小鼠结肠上皮细胞增殖率无差异。
图3
图3。杯状细胞分化异常，但结肠细胞和肠内分泌细胞分化不正常Klf4公司−/−老鼠。出生后第1天小鼠结肠的（A，B）苏木精和伊红染色
（A） 野生型小鼠的结肠上皮显示出正常的轮廓，沿着隐窝和表面上皮有许多杯状细胞（箭头所示）。（B） 相比之下，杯状细胞几乎不存在于Klf4公司−/−上皮细胞和突变小鼠的上皮细胞轮廓出现细微变化。结肠细胞基本正常。（C，D）出生后第1天小鼠结肠中嗜铬粒蛋白A（肠内分泌细胞标记物）的免疫组织化学。在野生型（C）和Klf4公司−/−小鼠（D）。在这两种情况下，肠内分泌细胞的数量都很低，每个横切面只有一到两个肠内分泌细胞。
图4
图4
Klf4公司−/−小鼠结肠杯状细胞数量显著减少。出生后第1天小鼠结肠酸性粘蛋白的（A–D）Alcian Blue染色。在低功率下，野生型小鼠（A）有大量Alcian Blue阳性细胞，但在Klf4公司−/−小鼠（B）。高倍镜下，阿尔西安蓝染色仅在野生型小鼠（C）的杯状细胞（箭头）中可见，而Klf4公司−/−小鼠（D）显示了大量上皮细胞，其中含有少量Alcian Blue染色物质（箭头所示），但没有正常的杯状细胞形态。
图5
图5
电子显微镜显示结肠上皮超微结构异常Klf4公司−/−老鼠。（A） 出生后第1天，野生型小鼠的结肠上皮显示出正常的杯状细胞形态（箭头所示）。细胞核（黑色箭头）密集排列，位于细胞底部，而细胞顶部主要由含有粘液的膜结合分泌液泡组成。正常结肠细胞（*）散布。（B，C）结肠上皮Klf4公司−/−出生后第1天的小鼠。（B） 观察到杯状谱系（箭头）中的几个形状异常或不成熟的细胞将其内容物排空至管腔。在这些细胞附近，一些细胞有密集的细胞核（黑色箭头），这表明是杯状细胞谱系，但缺乏典型的分泌液泡和正常的杯状细胞形状。结肠细胞（*），由其苍白的细胞质和较少浓缩的细胞核识别，看起来正常。（C） 结肠上皮Klf4公司−/−小白鼠的上皮细胞中也有散布的小簇分泌空泡（箭头）。比例尺：2μm。
图6
图6
杯状细胞标记的表达改变慕尼黑2在里面Klf4公司−/−老鼠。（A，B）原位杂交慕尼黑2出生后第1天在结肠中。（A） 野生型小鼠表现出杯状细胞特异性表达模式慕尼黑2mRNA（箭头）在顶端粘液颗粒附近表达丰富。染色仅在表面上皮细胞中显著。（B）Klf4公司−/−小鼠表达慕尼黑2mRNA（箭头）在上皮细胞中表达，但这种表达并不局限于杯状细胞。在整个上皮细胞中可见斑片状表达。
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