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.2002年4月；13(4):1313-28.
doi:10.1091/mbc.01-10-0525。

内胚体液泡上的双层网格蛋白涂层参与蛋白质向溶酶体的分选

马丁·萨克斯 1, 西尔维·乌尔贝, 维奥拉·奥尔肖特, Ger J Strous公司, 朱迪思·克伦普曼
附属公司

内胚体液泡上的双层网格蛋白涂层参与蛋白质向溶酶体的分选

马丁·萨克斯等。 分子生物学细胞. 2002年4月.

摘要

在许多细胞中，内胚体空泡显示出功能未知的网格蛋白外壳。在此，我们表明，该涂层主要存在于早期内体上，并且在电子显微镜下具有典型的双层外观。通过免疫电镜观察，我们发现被膜含有甲氰菊酯重链和轻链，但缺乏衔接复合体AP1、AP2和AP3，这与内吞小泡和再循环内体上的甲氰菊酯被膜不同。被毛对短时间与布雷费尔丁A孵育不敏感，但在磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂沃特曼的存在下消失。未发现内胚体包被区与微管蛋白或肌动蛋白的踪迹相关。通过定量免疫电镜，我们发现生长激素（GHR）和表皮生长因子的溶酶体靶向受体集中在被膜区，而循环转铁蛋白受体则不集中。此外，我们发现蛋白酶体抑制剂MG 132诱导截短的GHR（GHR-369）向循环小泡的重新分布，这与内体液泡相关的GHR-369向限制膜的非涂层区域的重新分布相一致。总之，这些数据表明，液泡内体上的双层网格蛋白外壳在将蛋白质靶向溶酶体方面发挥了作用。

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数字

图1
图1
内胚体液泡上的双层涂层含有网格蛋白重链和轻链。（A） 中国仓鼠卵巢细胞。在EE的扁平涂层区域发现了氯氰菊酯重链（10-nm金）。氯氰菊酯涂层由一个与内胚体限制膜相对的窄的电子致密层（箭头）和一个面向细胞质的较模糊层组成（箭头）。请注意，循环管与涂层区域相对出现（小箭头）。（B） 同样在wtGHR细胞中，在涂层区域发现了氯氰菊酯重链（10-nm金）（箭头所示）。注意，在向内发芽的小泡上没有发现标签（小箭头）。与A中一样，出现的小管与涂层区域没有连续性（小箭头）。（C） wtGHR细胞中早期内体的示例，在涂层区域标记为氯氰菊酯轻链（10-nm金）（箭头）。PM，质膜。棒材，200 nm。
图2
图2
双层涂层中没有氯菊酯适配器复合物AP1和AP2。（A） HeLa细胞标记γ-adaptin（10-nm金）。标签出现在EE附近的囊泡和小管上，但双层涂层上没有标签（箭头所示）。（B） WtGHR细胞标记β1/β2-adaptin（10-nm金）。标签位于氯氰菊酯涂层的凹坑（箭头），但不在双层涂层中（箭头）。（C） WtGHR细胞与10 mM brefeldin A孵育10分钟，并标记有网格蛋白重链（10-nm金）。在这个时间点上，布雷费尔丁A不会干扰双层涂层（箭头）。LE，晚期内体；PM，质膜。棒材，200 nm。
图3
图3
Wortmannin导致内胚体双层外套的消失。WtGHR细胞与100 nM沃特曼蛋白孵育45分钟。（A） Wortmanin诱导膨胀的内胚体空泡（V），这些空泡很少有可见的双层外壳，并且没有标记为网格蛋白（10-nm金）。相反，网格蛋白与细胞质小泡和小管的结合未受干扰（箭头）。（B） 早期内体标记物TfR（10-nm金）定位于肿胀的内体空泡的界膜。棒材，200 nm。
图4
图4
双层涂层与微管或肌动蛋白（A）HeLa细胞无关。溶酶体（L）与微管蛋白（10-nm金）的线性轨道相关。（B） 相反，微管蛋白与EEs上的涂层区域（箭头）无关。（C） 肌动蛋白（10-nm金）很容易在质膜（PM）附近和微绒毛突起中发现。（D） 当肌动蛋白位于脑电图的界膜附近时，它与包膜区无关（如箭头所示）。棒材，200 nm。
图5
图5
EGFR、Hrs和GHR集中在双层涂层中。（A和B）WtGHR细胞与生物素化GH孵育30分钟。（A）TfR（10-nm金）标记主要出现在RE中，其中一些位于早期内体（小箭头）附近。在EEs的限制膜处，TfR定位于涂层（箭头）和非涂层区域（箭头）。（B） GHR（10-nm金）存在于EE的限制膜和内部囊泡上。在限制膜上，GHR存在于涂层区域（箭头）。（C和D）HeLa细胞与EGF孵育10分钟。（C） EGFR（10-nm金）明显存在于EE的涂层区域（箭头所示）。（D）此外，Hrs（10-nm黄金）也局限于EE的涂敷区域（箭头）。PM，质膜。棒材，200 nm。
图6
图6
MG 132诱导内吞GHR-369的再循环。（A和B）GHR-369细胞与生物素化GH孵育1小时。（A）GH（10-nm金）存在于质膜（PM）和EEs中。（B） LE内囊泡上的GH（10-nm金）染色示例。（C） 表达GHR-369的细胞在MG 132存在下孵育1小时，随后在MG 132加生物素化GH的情况下孵育1小时。在EE的限制膜和内部囊泡上都发现GH（10 nm金）。注意，标记物存在于从液泡进化而来的小管中（箭头）。（D） 细胞按C处理，但使用GH代替生物素化配体，在过去30分钟内还添加了生物素化Tf。GH（10-nm金）和生物素（15-nm金）的双重标记显示电子致密RE（箭头）上的共定位。N、 核心。棒材，200 nm。
图7
图7
Syntaxin 7集中在双层外套膜（A）WtGHR细胞中。Syntaxin 7（10-nm金）主要局限于EEs的限制膜，在那里它积聚在双层涂层区域（箭头所示）。（B） 在HeLa细胞中，syntaxin 7（10-nm金）显示出类似的染色。棒材，200 nm。
图8
图8
聚合的证据线表明了一种模型，在该模型中，外套成分和下调受体之间的相互作用导致双层外套的滞留。这种保留浓缩了溶酶体途径的蛋白质，并将它们与回收蛋白质分离。未保留在双层外壳中的再循环蛋白质通过内胚体液泡，然后大量流入再循环内胚体（虚线-粗体线）。相反，进入溶酶体的蛋白质在外衣（连续粗体线）中的滞留将先于内吞小泡和随后运输到溶酶体。
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