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。2002年4月2日；99(7):4331-6.
doi:10.1073/pnas.072088099。 Epub 2002年3月26日。

蛋白酶-8亚型，即蛋白酶-8L，在内质网处招募到BAP31复合体

大卫·G·布雷肯里奇 1, Mai Nguyen女士, 斯蒂芬·库皮格, 迈克尔·雷思, Gordon C海岸
附属机构

蛋白酶-8亚型，即蛋白酶-8L，在内质网处招募到BAP31复合体

大卫·G·布雷肯里奇等。 美国国家科学院程序。 。

摘要

BAP31是内质网膜的一个完整蛋白，是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8的底物。在这里，我们描述了procasase-8亚型，procaspase-8L，它广泛表达并选择性地招募到BAP31复合体中，以响应E1A的凋亡信号。蛋白酶原-8L的特征在于N末端延伸（Nex）结构域，其在N末端延伸蛋白酶原-8/a，并且是蛋白酶原-8L与BAP31复合物选择性结合所必需的。基因缺失通过一种被BCL-2阻断的FADD依赖性机制识别出BAP31和相关的BAP29，作为处理procasase-8L以响应E1A的需要。此外，Bap29,31缺失以及一个Nex域显性负突变体减少了下游半胱氨酸天冬氨酸酶（IETDase和DEVDase）的激活以及E1A引起的细胞死亡。内质网中BAP31复合体优先招募procaspase-8L，这表明在细胞凋亡过程中调节启动子caspase-8的另一条途径。

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数字

图1
图1
在E1A诱导的凋亡过程中，Procaspase-8L被招募到BAP31复合物中。(A类)ER中crBAP31-Flag的示意图。Asp-164和Asp-238突变为Ala，Flag表位直接插入KKEE ER检索序列的前面。*，半胱天冬酶识别天冬氨酸残基。(B类)在E1A诱导的细胞凋亡过程中，crBAP31-Flag未被裂解。用5型腺病毒（Ad5）处理亲本KB细胞或稳定表达wt BAP31 Flag或crBAP31 Flag（水平略高于内源性BAP31）的KB细胞数字图书馆520E1B型负极（仅表达12个S E1A，不表达E1B产物），并通过SDS/PAGE和抗BAP31或抗Flag抗体的免疫印迹分析内源性BA、31、BAP31-Flag或crBAP31-Flag裂解。(C类)procasase-8的A≈62-kDa形式，即procasase-8L，被招募到BAP31复合体以响应E1A信号。用Ad5模拟感染或感染（E1A）稳定表达GFP-Flag、crBAP31-Flag或crBAP31-Flag和BCL-2的KB细胞数字图书馆520E1B型负极40 h后，用抗Flag M2凝胶进行免疫沉淀（IP），然后用SDS/PAGE和抗BAP31的Western blotting(中部)或针对p18亚单位的抗caspase-8抗体(底部). 如有指示，细胞在zVAD-fmk（50μm）存在下培养。还显示了相应的总细胞裂解物的免疫印迹（用于免疫沉淀的输入的5%）(顶部). 图中显示了传统的procasase-8亚型的位置，命名为/a和/b，它们的加工中间体（星号），caspase-8催化亚基（p18），procaspase-8L，crBAP31-Flag，内源性BAP31及其p20裂解产物。
图2
图2
procaspase-8L的特性和克隆。(A类)推导了预测的蛋白酶-8L N末端延伸（Nex）结构域的氨基酸序列。预测的procasase-8L上游起始密码子和Kozak翻译起始共识序列以粗体显示。指出了外显子3的位置以及典型的前蛋白酶-8/a和-8/b起始位点。用于生产procaspase-8L Nex结构域抗体的肽序列用黑色下划线表示。(B类)利用Nex结构域的5′端和典型caspase-8 p10亚基的3′端特异性引物对KB细胞mRNA的第一链cDNA进行PCR，结果表明，procaspase-8L的Nex结构区与整个procaspase-8/a ORF相连。逆转录（RT）-PCR产物如箭头所示。(C类)将亲和纯化的兔多克隆抗体提升至procaspase-8L的Nex结构域，检测人类H1299肺癌细胞中≈62 kDa的内源性蛋白（箭头，居中)和异位表达的procaspase-8L-HA。在存在50μM zVAD-fmk的情况下，用载体（−）或表达HA-标记的procaspase-8L（+）的载体转染细胞，24小时后，在存在或不存在10μM免疫肽的情况下通过Western blotting用所示抗体分析总细胞裂解物。(天)用识别前体蛋白的抗caspase-8单克隆抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀（10）。用抗caspase-8 p18亚单位特异性抗体或抗Nex结构域抗体对裂解产物和沉淀物进行印迹分析。(E类)蛋白酶-8L的组织分布。通过免疫印迹法对所示小鼠组织裂解物进行分析，如天用抗结核蛋白单克隆抗体重新进行印迹以进行负载控制。*，交叉反应产品。
图3
图3
procaspase-8L的亚细胞分布。(A类)KB细胞在等张缓冲液和P1核（500×克颗粒），重膜（HM）（9000×克颗粒），LM（100000×克颗粒）和细胞溶质S-100组分通过差速离心分离。分析组分中是否存在原蛋白酶-8L、原蛋白酶-8、ER标记物calnexin和线粒体标记物细胞色素c（c）氧化酶亚基IV（CoxIV），用相应抗体进行免疫印迹。(B类)分析啮齿类动物肝细胞膜的蔗糖密度梯度组分中是否存在蛋白酶-8L、BAP31和钙连蛋白，如A类. (C类)Procaspase-8L与光膜的细胞溶质表面有外周联系。(上部)用0.5M NaCl或碱（0.1M NaCO）萃取KB细胞的LM部分三pH 11.5），离心后，对膜丸（P；1和3道）和上清液（2和4道）进行分析，如下所示A类. (下部)将LM组分与（+）或（-）胰蛋白酶孵育，并通过免疫印迹法评估procaspase-8L、calnexin（ER跨膜蛋白）和BiP（ER管腔蛋白）的完整性。在一次反应中将TritonX-100添加到1%，以证明在LM微粒体部分溶解后BiP对胰蛋白酶敏感。
图4
图4
内源性procaspase-8L被招募到BAP31复合体中，并在E1A诱导的凋亡过程中被裂解。(A类)BCL-2阻止了procasase-8L的裂解。用Ad5感染亲代KB细胞（−BCL-2）或稳定表达BCL-2（+BCL-2数字图书馆520欧元负极在指定的时间内，在没有Nex抗体的情况下，用抗Nex抗体进行免疫印迹(上部)或存在(下部)Nex免疫肽（10μM）。(B类)z-VAD-fmk抑制procasase-8L的裂解。细胞被视为A类在没有或存在50μM zVAD-fmk的情况下。(C类)向BAP31复合体招募procasase-8L。将稳定表达crBAP31-Flag的KB细胞作为A类在感染后的指定时间，BAP31复合物被免疫沉淀（αFlag IP）。沉淀物的免疫印迹用抗Nex抗体开发(左上)然后剥离并用抗caspase-8（p18）抗体重制(右上)或抗BAP31抗体(下部). 抗Nex结构域和抗caspase-8（p18）抗体检测到相同的62-kDa蛋白。指出了内源性BAP31的p20和p27切割产物（与crBAP31-Flag异二聚）。给出了一个具有代表性的实验。
图5
图5
Procaspase-8L选择性地与BAP31复合物结合。(A类)在50μM zVAD-fmk存在下，用SDS/PAGE和Western blotting结合抗HA或抗Nex结构域抗体分析与所示表达构建物共转染的H1299细胞的抗-Flag免疫沉淀物。注意，只有procaspase-8L-HA免疫沉淀与BAP31-Flag.*，在裂解物中通过抗HA抗体检测到的一种非特异性蛋白质。(B类)Procaspase-8L在体外表达时诱导细胞活性丧失。在不存在或存在50μM zVAD-fmk的情况下，用荧光素酶表达构建体和表达原蛋白酶-8/a-HA或-8L-HA的pcDNA3载体转染H1299细胞，24小时后测量荧光素酶活性。(C类)Fas DISC中未检测到Procaspase-8L。用抗Apo-1/Fas（19）刺激H9淋巴细胞后，DISC被免疫沉淀，沉淀中存在的procaspase-8L和procaspase-8通过免疫印迹法进行评估，如图4所示C类IgG，Ig重链。(天)重量或Fadd（传真）-缺乏的小鼠胚胎成纤维细胞（20）感染了Ad5数字图书馆520E1B型负极50小时后，如图4所示分析蛋白酶-8L裂解A类。
图6
图6
E1A诱导的caspase-8活性和凋亡被procaspase-8L DN突变体抑制。(A类)将KB细胞与编码12S E1A和Nex-Flag-EGFP或12S E1A和Flag-EGFP的质粒瞬时共转染，并在转染后36 h检测等量的细胞裂解物水解caspase-8首选底物IETD-amc的能力。显示的是四个独立实验的平均值。(B类)细胞裂解物来自A类用抗E1A或Flag抗体进行SDS/PAGE和免疫印迹分析。(C类)如中所示A类除收集细胞外，用Annexin V染色并用流式细胞仪分析。通过免疫荧光分析EGFP阳性细胞，估计转染效率为20-30%（未显示）。
图7
图7
Procaspase-8L处理在Bap29,31-空单元格。(A类)损失巴普29和Bap31型用抗BAP31和抗Bap29抗体进行免疫印迹证实表达。(B类)E1A诱导的procaspase-8L裂解在Bap29,31-空ES单元格。ES细胞分化为上皮细胞和成纤维细胞样细胞，如材料和方法，并感染了Ad5数字图书馆520E1B型负极在指定的时间内。如图3所示分析原天冬酶-8L切割A类. (C类)如中所示B类用抗Nex和抗caspase-8（p18）抗体分析procaspase-8L、procaspase 8/a和-8/b的裂解。(天)caspase-8活性降低Bap29,31-空单元格。野生型和Bap29,31-用E1A刺激空白细胞（含等效蛋白浓度）24小时（caspase活性最大时间），测试其水解首选caspase-8底物IETD-amc的能力。所示为三个独立实验的平均值。RFU，相对荧光单位。(E类)DEVD-ase活性降低Bap29,31-空单元格。如中所示C类，但对裂解产物进行了水解caspase-3首选底物DEVD-amc的能力测试。(如果)感染后72小时用台盼蓝排斥法测定细胞死亡。所示为四个独立实验的代表。
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