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.2002年4月1日；157(1):103-13.
doi:10.1083/jcb.200107108。 Epub 2002年3月26日。

鞭毛内转运蛋白IFT88对脊椎动物感光细胞的组装和维护至关重要

格雷戈里·帕佐 1, 希拉·A·贝克, 詹姆斯·迪恩, 道格拉斯·科尔, 贝萨尼·L·迪克特, 乔尔·罗森鲍姆, 乔治·B·威特曼, 约瑟夫·贝沙斯
附属机构

鞭毛内转运蛋白IFT88对脊椎动物感光细胞的组装和维护至关重要

格雷戈里·帕佐等。 J细胞生物学. .

摘要

每天大约有10%的光感受器外段（OS）被翻转，需要将大量的脂质和蛋白质从内段转移到OS。光感受器内转运缺陷可导致视网膜退化和失明。转运机制尚不清楚，但由于OS是一种修饰纤毛，鞭毛内转运（IFT）是一种候选机制。IFT涉及大蛋白复合物沿纤毛微管的运动，是纤毛组装和维持所必需的。我们发现IFT颗粒蛋白定位于连接纤毛的光感受器。我们进一步发现，IFT颗粒蛋白基因Tg737/IFT88突变的小鼠出现OS发育异常和视网膜变性。因此，IFT对于脊椎动物OS的组装和维护非常重要。

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数字

图1。
图1。
小鼠睾丸和视网膜中的IFT蛋白。（a和b）对小鼠睾丸蛋白质提取物的蔗糖密度梯度（5-20%）分析表明，IFT88、IFT57、IFT52和IFT20在～17S时结合。（a） 库马西蓝染色凝胶，分子量标记单位为kD，如右图所示。（b） 四种IFT蛋白的蛋白质印迹（标记在右侧）。附加缩写：L，上清液蛋白加载梯度；P、 从最初的蛋白质提取中提取的颗粒。（c） 视网膜提取物的Western blot显示在Tg737中IFT88（箭头）显著降低−/−（mt）小鼠与野生型（wt）小鼠在p21的比较。（d） 免疫荧光图像显示，IFT88（绿色）位于野生型小鼠视网膜连接纤毛的末端（红色，箭头），但在Tg737突变视网膜中未发现。通过乙酰化微管蛋白抗体（红色）检测连接纤毛。棒材，20μm。
图2。
图2。
IFT颗粒蛋白存在于牛的光感受器中。（a和b）蛋白质印迹显示在富含纤毛轴突的牛DEPC制剂中存在IFT颗粒蛋白。针对小鼠IFT颗粒蛋白的抗体可识别预测大小的单一条带（IFT88，90 kD；IFT57，57 kD；IFT52，52 kD；EFT20，16 kD）。左边（a）和右边（b）的数字是分子量标记。（c） 新鲜冷冻牛视网膜共聚焦免疫细胞化学图像，从左到右标记有IFT88、IFT57、IFT52和IFT20抗体。IFT颗粒蛋白主要定位于IS。染色在连接纤毛所在的IS和OS层的交界处呈点状。染色也见于外丛状层（OPL），即光感受器突触终末所在的位置，在较小程度上也见于ONL。INL表示内核层。（d–j）IFT颗粒蛋白定位于感光细胞纤毛和基底体。（d） 用牛视紫红质的B6-30N（绿色）单克隆抗体标记牛OS（Besharse和Wetzel，1995年），用K26（红色）单抗标记连接纤毛。（e和f）轴突用乙酰化α-微管蛋白单克隆抗体标记（绿色），连接纤毛用K26标记（红色）。箭头表示纤毛的远端。（g–j）连接纤毛用K26（红色）检测，而IFT20（g）、IFT52（h）、IFT57（i）和IFT88（j）用亲和纯化的兔抗体（绿色）检测。箭头表示纤毛的远端。（k–m）用IFT57（蓝色）抗体标记的三重标记图像叠加在连接纤毛（K26，红色）和乙酰化α-微管蛋白（绿色）的标记上。k–m中的小箭头表示标记位于连接纤毛的远端；大箭头表示靠近连接纤毛的标记。棒材：（c）20μm；（d和e）10μm；（f） 5微米；（m） 2微米；（g–j）指e；（k和l）指m。
图3。
图3。
Tg737突变小鼠p10处的杆细胞OS异常。（A） 典型的野生型视网膜在p10显示OS发展程度（箭头）。（B） 与野生型相比，p10处的Tg737突变体视网膜显示更小、密度更低的OS（箭头）。RPE表示视网膜色素上皮。（C和D）第10页野生型动物中的OS示例。在C语言中，箭头表示与正常操作系统相邻的异常操作系统。这种非典型OS仅在野生型小鼠中偶尔观察到。在D中，箭头表示在连接纤毛（CC）附近形成的圆盘。（E和F）第10页Tg737突变小鼠中异常OS的典型示例。断裂的椎间盘（E，箭头）和延伸到自身IS的OS（F，箭头）在p10的Tg737突变视网膜中广泛存在。棒材：（A和B）10μm；（C–F）1μm。
图4。
图4。
杆状细胞OS异常，视蛋白在Tg737突变小鼠p21处定位错误。（a和b）甲苯胺蓝染色切片表明，与野生型（a）的类似切片相比，突变OSs（b）的组织结构和密度更低。（c和d）第21页野生型（c）和Tg737突变型（d）视网膜冰冻切片中视杆蛋白（红色）和IFT88（绿色）的免疫细胞化学。野生型和突变体动物都显示出杆状OS的强视蛋白染色，但在突变体的is和细胞核周围（ONL）也检测到视蛋白。IFT88存在于is（c）中，但在突变体（d）中减少。（e和f）IS层和OS层之间连接处的电子显微照片，表明突变（f）光感受器在结构和组织上不如野生型光感受者（e）均匀，并积聚细胞外囊泡（EV）。其他缩写与图2和图3中的相同。棒材：（a和b）20μm；（c和d）40μm；（e和f）1μm。
图7。
图7。
Tg737突变小鼠OSs中视杆蛋白和ROM1的EM水平免疫细胞化学定位。（a和b）视蛋白在p21野生型视网膜OS中的分布。OS的免疫反应丰富，但在is质膜（ISPM）和连接纤毛（CC）中检测到非常低的水平。（c和d）视蛋白在第21页Tg737突变视网膜的OSs中的分布。Opsin在突变型OS中的含量与野生型相似，但在is质膜和连接纤毛中的含量远高于野生型。此外，视蛋白存在于野生型动物未发现的细胞外囊泡（EV）中。（e–g）ROM1在野生型（e）和Tg737（f和g）光感受器中的分布。ROM1（箭头）位于野生型动物的椎间盘边缘和切口处。在那些表现出有组织圆盘（f）的Tg737突变杆中检测到类似的模式，但ROM1在具有无组织圆盘（g）的OS中的含量似乎要少得多。棒材：（b和c）1μm；（e、f和g）0.5μm；（a） 参考c；（d） 参见b。
图5。
图5。
光镜图像显示Tg737突变小鼠的感光细胞逐渐丢失。（A） p77典型野生型视网膜的全厚切片。（B–D）Tg737突变小鼠p45、p77和p84的视网膜全厚视图，显示ONL的细胞核丢失，IS和OS层逐渐变薄。所有图像均来自用甲苯胺蓝染色的1μm厚塑料切片。其他缩写：G，神经节细胞层；INL，内核层；IPL，内丛状层；OPL，外丛状层。棒材，20μm。
图6。
图6。
EM图像显示Tg737纯合突变体p45和p77的异常感光细胞组织。（A） 来自野生型动物的典型组织良好的OS的图像。（B–D）Tg737突变小鼠p45。丰富的细胞外囊泡（D，小箭头），在活体感光体之间有无定形内部积聚；这在野生动物中从未见过。在感光层（D，大箭头）中经常可以看到收缩、死亡的感光细胞，有时在感光细胞中可以看到巨噬细胞（B，M）。（E和F）第77页感光细胞晚期丢失。在E中，色素上皮（RPE）附近可见一个异常的OS，相对正常的椎间盘被异常大的椎间膜包围。在F中，在RPE附近可以看到单个发育不全的OS，其具有轮匝的椎间盘膜及其连接纤毛（CC）。请注意，米勒细胞体（MC）及其之间的连接复合体（F，箭头）通常通过感光层IS和OS层的全厚度与RPE分离，与F.Bars中的RPE在同一视野中可见：（A和E）1μm；（B、D和F）指A；（C） 参见E。
图8。
图8。
感光细胞IFT模型。细胞质动力蛋白1将小泡从高尔基体堆积物运输到连接纤毛的底部。IFT颗粒与小泡相结合，小泡在连接纤毛的底部与纤毛或质膜融合。带附着货物的IFT颗粒随后通过驱动蛋白II通过连接纤毛运输。在连接纤毛的远端，IFT颗粒与其货物分离，膜组织成盘状，IFT微粒被细胞质动力蛋白1b/2拾取并返回细胞体。
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