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.2002年3月；22(5):1288-97.
doi:10.1128/MCB.22.51288-1297.2002。

在TFIIH和对T环磷酸化具有不同敏感性的Kin28-Ccl1-Tfb3三聚体复合物中发现Kin28

迈克尔·克里斯托弗·基奥 1, Eun-Jung Cho先生, 弗拉基米尔·波多尔尼, 斯蒂芬·布拉托夫斯基
附属公司

在TFIIH和对T环磷酸化具有不同敏感性的Kin28-Ccl1-Tfb3三聚体复合物中发现Kin28

迈克尔·克里斯托弗·基奥等。 分子细胞生物学. 2002年3月.

摘要

基础转录因子TFIIH磷酸化转录起始复合物内的RNA聚合酶II（RNApII）羧基末端结构域（CTD）。TFIIH的催化激酶亚单位是细胞周期依赖激酶（Cdk）家族的成员，在酿酒酵母中称为Kin28，在高等真核生物中称为Cdk7。与TFIIH亚单位cyclin H和Mat1一起，Cdk7激酶也在一种称为Cdk活化激酶（CAK）的三聚体复合体中发现。虽然已经分离出一种称为TFIIK的Kin28-Ccl1二聚体作为TFIIH的分解产物，但之前还未鉴定出酵母三聚体复合物。在这里，我们表明在酵母提取物中存在Kin28-Ccl1-Tfb3的三聚体复合物。创造了几个CTD磷酸化缺陷的Kin28点突变体。与早期的研究一致，这些突变体在体外没有转录缺陷。与其他Cdk一样，Kin28通过T环T162上的磷酸化激活。Kin28 T162突变体单独没有生长缺陷，但与细胞周期蛋白伙伴Ccl1的突变体结合时确实表现出合成表型。令人惊讶的是，这些磷酸化位点突变体似乎破坏了TFIIH上下文中细胞周期蛋白亚基的结合，但没有破坏三聚体复合体中的结合。

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图1。
图1。
Kin28突变体的体内分析。（A） 蛋白质水平。所示的HA标记的Kin28突变体被用于通过质粒洗牌替换酵母中野生型（WT）基因的产物。在酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基中，从30°C指数生长的培养物中提取的总蛋白通过SDS-PAGE进行解析，并测定Kin28（抗Kin28[α-Kinn8]，兔多克隆抗体）、磷酸化Rpb1 CTD（CDD*p；B3单克隆抗体）和TATA结合蛋白（TBP）（抗TBP[α-TBP]免疫印迹法检测兔多克隆抗体。长期接触后可检测到低水平的K36A蛋白（未显示）。WCE，全细胞提取物。（B） Kin28（K36A）的过度表达部分抑制了突变体产生的缓慢生长表型。使用携带指示突变的低拷贝数（CEN/ARS）或高拷贝数（2μm）质粒进行质粒改组金28基因。菌株在YPD平板上划线，并在30°C下培养3天（左）。使用识别HA标签（α-HA）的12CA5单克隆抗体，通过免疫印迹法（右）检测突变菌株的Kin28蛋白水平。使用抗Tfb1（α-Tfb1）的多克隆抗体作为核心TFIIH水平的对照。
图2。
图2。
Kin28突变体的功能分析。（A） CTD激酶活性。含Kin28的复合物通过HA标签与12CA5蛋白A珠免疫沉淀（ip）。按照材料和方法中的描述，对指示的蛋白质进行免疫印迹分析（顶部）和体外CTD激酶分析（底部）。请注意，K36A突变等位基因携带在高拷贝数质粒上，而其他等位基因则携带在低拷贝数质粒中，因此Kin28蛋白水平具有可比性。野生型；CTD*p，磷酸化Rpb1 CTD。（B） 转录活性。从指示菌株中制备全细胞提取物，并使用线性质粒模板分析体外转录。对基础转录和活化转录进行了测试（分别在没有[-]和有[+]Gal4-VP16的情况下）。Lane MW，放射性标记分子大小标记（核苷酸）。
图3。
图3。
Kin28在T环内的T162上磷酸化。（A） 野生型（WT）Kin28全细胞提取物（WCE）的免疫印迹分析表明，该蛋白以对应于磷酸化和非磷酸化物种的双重体形式迁移。T162A突变蛋白以单一带的形式迁移。Kin28*p，磷酸化Kin28；TBP，TATA-结合蛋白。（B） 使用12CA5单克隆抗体通过HA标签免疫沉淀（IP）HA标记的Kin28，并用λ-磷酸酶（Ppase）处理。快速迁移带消失，表明迁移率变化依赖于磷酸化。HA标记的Kin28（T162A）[Kin28.HA（T162A]突变体被用作非磷酸化形式的凝胶流动性标准。
图4。
图4。
Kin28突变体对紫外线诱导的DNA损伤不敏感。将含有所示Kin28和Tfb1突变体的平板暴露于增加剂量的短波紫外线（200μW/s/cm2)，并对存活的菌落进行计数。每个时间点产生的存活率表示为每个菌株未处理对照的百分比。紫外线敏感型Tfb1羧基末端截断突变体（tfb1型-6和tfb1型-101[49]）作为对照。WT，野生型。
图5：。
图5：。
酿酒酵母包含两个含Kin28的复合物。酿酒酵母创建了含有His-tagged Tfb1（Tfb1.6His）和HA-taged Kin28（Kin28.HA）的菌株。制备全细胞提取物（WCE）并通过BioRex-70和磷酸纤维素柱。Kin28的两个峰从磷酸纤维素柱洗脱，尽管只有一个峰也含有Tfb1（中心斑点）。这两个峰分别经过Ni-NTA琼脂糖进一步纯化，并通过Kin28上的HA标签进行免疫沉淀。进行免疫印迹分析以确定所得纯化复合物I和II的组成。两者均含有Kin28、Ccl1和Tfb3。复合物II也含有Tfb1，确定该峰为TFIIH。
图6。
图6。
配合物I是Kin28、Ccl1和Tfb3的三聚体。免疫纯化复合物I（ProtA:α-HA）进行SDS-PAGE，然后进行银染和免疫印迹分析。作为阴性对照，在没有抗HA抗体（ProtA）的情况下沉淀复合物I的Ni-NTA流通部分。蛋白质A和免疫球蛋白重链和轻链（分别为IgH和IgL）的位置已标明。用抗Ccl1、Tfb3或Kin28抗体进行免疫印迹显示，这些蛋白质与适当大小的银染物种对齐。注意，免疫球蛋白也在抗HA免疫印迹中检测到。
图7。
图7。
T162突变体复合物I三聚体和TFIIH的功能分析。从含有野生型（WT）Kin28或T162A或T162D突变体的菌株中生化纯化Trimer和TFIIH复合物，如图5和材料与方法中所述。在通过HA表位标签进行最终纯化后，对所得复合物进行SDS-PAGE和免疫印迹分析（Western；top）。免疫沉淀也用于体外CTD磷酸化分析（底部）。GST-CTD*P，磷酸化GST-CTD。
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    1. Ausubel，F.M.、R.Brent、R.E.Kingston、D.D.Moore、J.G.Seidman、J.A.Smith和K.Struhl（编辑）。1991年，分子生物学的现行协议。John Wiley&Sons，纽约州纽约市。
    1. Beelman，C.A.、A.Stevens、G.Caponigro、T.E.LaGrandeur、L.Hatfield、D.M.Fortner和R.Parker。1996年。脱盖酶的一个基本成分，需要正常的mRNA周转率。《自然》382:642-646。-公共医学

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