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.2001年12月1日；15(23):3118-29.
doi:10.1101/gad.934801。

芽殖酵母蛋白激酶Ipl1/Aurora允许不存在张力来激活纺锤体检查点

S比金斯 1, A W穆雷
附属公司

芽殖酵母蛋白激酶Ipl1/Aurora允许不存在张力来激活纺锤体检查点

S比金斯等。 基因开发. .

摘要

纺锤体检查点阻止有丝分裂纺锤体缺陷细胞的细胞周期进展。虽然几个主轴缺陷激活了主轴检查点，但主信号的确切性质尚不清楚。我们发现，Aurora蛋白激酶家族的芽殖酵母成员Ipl1p需要维持纺锤体检查点阻滞的子集。Ipl1p是维持蛋白激酶Mps1过度表达诱导的纺锤体检查点所必需的。Ipl1p失活可使过表达Mps1p的细胞逃避有丝分裂并正常分离染色体。因此，主轴检查点对Ipl1p的要求不是动粒和/或主轴缺陷的结果。对Ipl1p的要求区分了纺锤体检查点的两种不同激活物：Ipl1p功能是由动粒不受张力的染色体触发的延迟所必需的，但对于纺锤体解聚诱导的阻滞则不需要。在有丝分裂期间，Ipl1p定位于动粒或其附近，我们认为Ipl1p是监测动粒张力所必需的。

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图1
图1
国际石油公司1尽管存在染色体分离缺陷，但突变体并没有激活纺锤体检查点。野生型（SBY818）和ipl1-321号机组含有Pds1-myc18的细胞（SBY819）在G1在允许温度（23°C）下使用α因子，并释放到非允许温度（37°C）。当小芽形成时，α-因子被添加回来，以阻止细胞进入下一个细胞周期。(A类)在指定的时间点制备裂解液，并用抗myc抗体进行免疫印迹，以分析Pds1-myc蛋白水平。Pds1p水平在野生型细胞和国际石油公司1突变细胞，表明纺锤体检查点未被激活。根据Ponceau S染色判断，所有通道中的蛋白质浓度相等（数据未显示）。(B类)在同一实验中，用显微镜定量了出芽细胞的百分比，并显示野生型（填充正方形）和ipl1-321号机组细胞（开口方块）以类似的动力学经历出芽和胞质分裂。(C类)在同一个实验中，IV号染色体分离百分比被监测为将IV号染色体的两个GFP标记拷贝分离到纺锤体相反两极的细胞分数。虽然IV号染色体在野生型细胞（填满的方块）中分离，但在ipl1-321号机组单元格（开放正方形）。
图2
图2
需要Ipl1p来维护GAL-MPS1型检查站逮捕。GAL-MPS1型（SBY679）和GAL-MPS1管道1-321将（SBY680）细胞在半乳糖中滞留3.5 h，然后释放到非允许温度（35°C）进行灭活国际石油公司1. (A类)用抗myc抗体免疫印迹法监测Pds1-myc蛋白水平。Pds1水平在GAL-MPS1管道1-321单元格与GAL-MPS1型电池，表示需要Ipl1p来全面维护GAL-MPS1型检查站逮捕。(B类)在同一实验中，用抗myc抗体免疫印迹法监测Mps1水平。这两种菌株的Mps1蛋白水平都下降，但在ipl1-321号机组细胞。根据Ponceau S染色判断，所有通道中的蛋白质浓度相等（数据未显示）。(C类)通过GFP标记的IV号染色体的显微镜监测IV号染色体分离。该染色体正常分离为GAL-MPS1型单元格（填充正方形）和GAL-MPS1管道1-321牢房（开放广场）离开了检查站。
图3
图3
(A类)诺卡唑引起的检查站逮捕不需要Ipl1p。野生型（SBY818），ipl1-321号机组（SBY819），mad2Δ（SBY920），以及bub2Δ含有Pds1-myc18的（SBY934）细胞在G1允许温度（23°C）下的α系数。在非允许温度（37°C）下，将其释放到诺卡唑和苯诺明中，并在出现小芽时添加α-因子，以阻止细胞进入下一个细胞周期。通过免疫印迹分析Pds1p水平，显示野生型，ipl1-321号机组、和bub2Δ突变细胞激活纺锤体检查点，因为它们保持高Pds1水平。Pds1p水平循环mad2Δ突变细胞，缺乏纺锤体检查点。根据Ponceau S染色判断，所有通道中的蛋白质浓度相等（数据未显示）。(B类)IPL1级在中不起作用业务单元2-依赖性检查点通路。野生型（SBY214），ipl1-321号机组（SBY322），以及bub2Δ在非允许温度下，将（SBY432）突变细胞释放到诺卡唑和苯诺明中。监测大芽细胞的百分比，显示野生型（填充方块）和ipl1-321号机组细胞（阴影正方形）以大芽细胞的形式停滞，而bub2Δ细胞（灰色方块）重新构建，表明Ipl1p与Bub2p不在同一途径中。
图4
图4
Ipl1p是由动粒张力缺陷引起的检查点阻滞所必需的。(A类)耗尽Cdc6蛋白的细胞在允许温度（23°C）下生长，并在G1具有α因子。然后从G中释放细胞1在葡萄糖中保持非允许温度（37°C）镀锌-CDC6压抑；免疫印迹法分析Pds1p水平。Pds1p水平在野生型细胞（SBY818）中循环，但在镀锌-CDC6细胞在抑制培养基（SBY772）中生长。Pds1p水平在GAL-CDC6 mad1Δ（SBY762）和GAL-CDC6第1-321页（SBY771）突变细胞，表明检查点未激活。(B类)mcd1-1型（SBY870）和mcd1-1 ipl1-321细胞（SBY871）在G中被捕1允许温度下的α因子。在不含α-因子的情况下，将其释放至非允许温度（37°C），并通过免疫印迹法监测Pds1-myc18蛋白水平。Pds1p在mcd1/scc1突变细胞在mcd1-1 ipl1-321细胞，表明Ipl1p是姐妹染色单体内聚缺陷诱导的纺锤体检查点所必需的。根据Ponceau S染色判断，所有通道中的蛋白质浓度相等（数据未显示）。
图5
图5
Ipl1p在中期定位于动粒。(A类)Ipl1p在中期停搏期间定位于动粒。Cdc26Δ将含有Cse4p–myc13和Ipl1p–HA3（SBY961）的细胞移到非允许温度（37°C）下3小时，使其在中期停滞。进行染色体扩散并用DAPI染色以识别DNA(左边面板），并用抗myc和抗HA抗体分别识别Cse4p和Ipl1p(中间的面板）。合并的图像(正确的面板）显示Ipl1p和Cse4p在中期停搏期间共定位。(B类)Ipl1p在检查站逮捕期间定位到动粒。将含有Ndc10p–HA3和Ipl1p–myc12（SBY596）的细胞在23°C下在诺可达唑中阻滞3小时。进行染色体扩散并用DAPI染色以识别DNA(左边面板），并使用抗HA和抗myc抗体分别识别Ndc10p和Ipl1p(中间的面板）。合并的图像(正确的Ndc10p和Ipl1p图像的面板）显示，在检查点逮捕期间，Ipl1p+Ndc10p+kinetochores共定位。
图6
图6
Ipl1p在主轴装配期间监测张力的作用模型。为了简单地说明动粒取向，显示了端粒染色体。在有丝分裂早期，动粒既不附着在微管上，也不处于张力下（充满黑色的动粒）。将两个姐妹染色单体连接到同一个极（单向）产生的动粒不受张力，但与微管结合（灰色填充的动粒）。一旦建立了生物定向纺锤，动粒上就会产生张力（开放动粒）。主轴检查点必须监控连接和张力中的缺陷，以确保双极主轴组件。我们的实验表明，Ipl1p在监测紧张状态方面具有特殊作用，但在监测依恋方面没有作用。
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