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.2001年12月；21(24):8575-91.
doi:10.1128/MCB.21.24.8575-8591.2001。

体内主要应激诱导的hsp70分子伴侣的调控和功能：对hsp70.1或hsp70.3基因靶向基因断裂小鼠的分析

L Huang（L黄） 1, N F米维奇, 莫斯科菲氏菌
附属公司

体内主要应激诱导的hsp70分子伴侣的调控和功能：对hsp70.1或hsp70.3基因靶向基因断裂小鼠的分析

L Huang（L黄）等。 分子细胞生物学. 2001年12月.

摘要

小鼠hsp70基因家族包括进化上保守的hsp70.1和hsp70.3基因，它们是热和其他应激刺激诱导的主要蛋白质。hsp70.1和hsp70.3编码相同的蛋白质，保护细胞并促进其从应激诱导的损伤中恢复。虽然hsp70基因家族已被广泛研究，其编码的蛋白质作为分子伴侣在一系列人类病理学中的作用也得到了重视，但对hsp70.1和hsp70.3表达的发育调控及其产物的体内生物功能知之甚少。为了直接研究这些蛋白质在体内的生理作用，我们用框架内β-半乳糖苷酶序列替换hsp70.1或hsp70.3基因，生成了热休克蛋白70（hsp70）缺陷的小鼠。我们在此报告，hsp70.1和hsp70.3的表达在转录水平上受到发育调控，并且在胚胎发育期间和成年小鼠组织中观察到这两个基因的重叠表达模式。hsp70.1/-或hsp70.3/-小鼠可以存活和繁殖，没有明显的形态学异常。在胚胎晚期和成年小鼠中，这两个基因在直接接触环境的组织（表皮和角膜）和某些内部器官（舌、食道和前胃的上皮，以及肾、膀胱和海马）中组成性表达。小鼠暴露在热应激下会导致hsp70的快速诱导和表达，尤其是在非组成性表达hsp70器官（肝脏、胰腺、心脏、肺、肾上腺皮质和肠道）。尽管完整的同源基因（即hsp70.1/-小鼠中的hsp70.3，反之亦然）对单基因缺陷小鼠进行了功能补偿，但在正常和热应激条件下，组织中hsp70蛋白表达均显著降低。在细胞水平上，hsp70.1或hsp70.3失活导致获得性耐热性维持不足，并增加了对热应激诱导凋亡的敏感性。因此，强调了两个hsp70基因共表达所显示的加性或协同效应，以及两个hsp 70基因存在的进化意义。

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数字

图1
图1
靶向载体的构建热休克蛋白70.1和热休克蛋白70.三基因与小鼠的世代热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.三基因。的限制地图热休克蛋白70.三（A） 或热休克蛋白70.1（D） 基因，显示野生型等位基因（顶部）、靶向载体（中部）和同源重组后预测的靶向等位基因。的位置新-lacZ公司以及用于Southern印迹分析的TK盒和探针。载体的设计使每个载体的启动子热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.三基因驱动β-半乳糖苷酶的表达。Southern blotting检测正确基因靶向的探针是一个0.4 kb的3′片段(巴姆嗨-Hin公司dIII）对于热休克蛋白70.三基因座与1.2kb(巴姆HI（高）-巴姆HI）碎片热休克蛋白70.1基因位点。限制性内切酶指定如下：R，生态RI；B、，巴姆嗨；A、，阿帕我；N、，不是我；H、，Hin公司dIII；E、，生态中国国际广播电台。箭头指示的是热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.三等位基因。（B和D）来自野生型（+/+）、杂合型（+/-）或纯合型（−/-）的尾部DNA的Southern blotting分析热休克蛋白70.三小鼠（B）或热休克蛋白70.1突变小鼠（D）。更换热休克蛋白70.三基因由新-lacZ公司除了6-kb野生型片段外，盒式磁带还产生了一个9-kb片段，并替换了热休克蛋白70.1该基因产生12和9 kb片段。（C和F）基于PCR-的基因分型分析扩增0.6和1.1 kb的野生型和靶向片段热休克蛋白70.三基因座（C）和0.5和1.0 kb的片段热休克蛋白70.1基因座（F）。
图2
图2
胚胎发育后期hsp70.3或hsp70-3的组织特异性组成性表达。热休克蛋白70.1+/−和热休克蛋白70.三+/−胚胎于E17取回，冷冻、切片、固定并用X-Gal染色。切片用曙红（粉红色）复染。箭头表示蓝色β-半乳糖苷酶表达。组织来自皮肤、鼻腔、舌头、食道、胃、前胃和肾脏。请注意热休克蛋白70i仅在前胃上皮中观察到表达（箭头所示），而在胃上皮中没有发现组成性表达。舌头、胃和前胃的放大倍数，×20。皮肤放大倍数，×200。所有其他组织的放大倍数，×50。
图2
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胚胎发育后期hsp70.3或hsp70-3的组织特异性组成性表达。热休克蛋白70.1+/−和热休克蛋白70.三+/−胚胎于E17取回，冷冻、切片、固定并用X-Gal染色。切片用曙红（粉红色）复染。箭头表示蓝色β-半乳糖苷酶表达。组织来自皮肤、鼻腔、舌头、食道、胃、前胃和肾脏。请注意热休克蛋白70i仅在前胃上皮中观察到表达（箭头所示），而在胃上皮中没有发现组成性表达。舌头、胃和前胃的放大倍数，×20。皮肤放大倍数，×200。所有其他组织的放大倍数，×50。
图3
图3
成年小鼠组织特异性组成性hsp70.1和hsp70.3的表达。野生型对照组的组织（C57BL/6-129/SvJ）F2,热休克蛋白70.1+/−，或热休克蛋白70.三+/−成年小鼠（8至12周龄）收获、冷冻、切片、固定并用X-Gal染色。切片用曙红（粉红色）复染。箭头表示蓝色β-半乳糖苷酶活性。热休克蛋白70i皮肤、舌头、食道、前胃、海马、角膜、肾脏、肾小球和膀胱均有表达。海马体放大倍数，×30。食道和肾脏放大倍数，×70。皮肤、舌头和前胃放大倍数，×145。所有其他组织的放大倍数，×290。
图3
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成年小鼠组织特异性组成性hsp70.1和hsp70.3的表达。野生型对照组的组织（C57BL/6-129/SvJ）F2,热休克蛋白70.1+/−，或热休克蛋白70.三+/−成年小鼠（8至12周龄）收获、冷冻、切片、固定并用X-Gal染色。切片用曙红（粉红色）复染。箭头表示蓝色β-半乳糖苷酶活性。热休克蛋白70i皮肤、舌头、食道、前胃、海马、角膜、肾脏、肾小球和膀胱均有表达。海马体放大倍数，×30。食道和肾脏放大倍数，×70。皮肤、舌头和前胃放大倍数，×145。所有其他组织的放大倍数，×290。
图4
图4
组织特异性组成性hsp70i蛋白表达在热休克蛋白70.1-或热休克蛋白70.3-与野生型对照组相比，缺陷成年小鼠。通过从野生型（+/+）、杂合型（+/-）或纯合型（−/-）的脑、皮肤、食道、前胃和肾组织中提取的免疫印迹蛋白来评估hsp70i蛋白的水平热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.三老鼠。作为等蛋白负荷的对照，检测印迹中的肌动蛋白。
图5
图5
组织特异性热休克蛋白70.1和热休克蛋白70.三成年小鼠全身热疗后的诱导。热休克蛋白70.1+/−和热休克蛋白70.三+/−成年小鼠（8至12周龄）在42°C的循环水浴中半浸45分钟，然后在安乐死前恢复6小时。未经处理热休克蛋白70.1+/−小鼠作为对照组（左侧面板）。如图3图例所示，制备组织并对其进行β-半乳糖苷酶活性染色。箭头表示蓝色β-半乳糖苷酶染色。在野生型小鼠的任何组织切片中均未检测到β-半乳糖苷酶活性（数据未显示）。热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.三肝脏、小肠、胰腺、肾上腺、脾脏、心脏和睾丸均有表达。肾上腺和心脏放大倍数，×70。所有其他组织的放大倍数，×145。
图5
图5
组织特异性热休克蛋白70.1和热休克蛋白70.三成年小鼠全身热疗后的诱导。热休克蛋白70.1+/−和热休克蛋白70.三+/−成年小鼠（8至12周龄）在42°C的循环水浴中半浸45分钟，然后在安乐死前恢复6小时。未经处理热休克蛋白70.1+/−小鼠作为对照组（左侧面板）。如图3图例所示，制备组织并对其进行β-半乳糖苷酶活性染色。箭头表示蓝色β-半乳糖苷酶染色。在野生型小鼠的任何组织切片中均未检测到β-半乳糖苷酶活性（数据未显示）。热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.三肝脏、小肠、胰腺、肾上腺、脾脏、心脏和睾丸均有表达。肾上腺和心脏放大倍数，×70。所有其他组织的放大倍数，×145。
图6
图6
全身热疗后hsp70i蛋白表达诱导减少热休克蛋白70.1-和热休克蛋白70.三-缺陷成年小鼠。野生型（+/+）、杂合型（+/-）或纯合型（−/−）热休克蛋白70.1-或热休克蛋白70.三-将缺陷小鼠麻醉，进行热休克（42℃持续45分钟），并在安乐死前恢复6小时（指示42℃）。对照组为麻醉但未接触热休克的小鼠（显示为C）。用hsp70i（C92）特异性抗体免疫印迹法评估不同组织的蛋白提取物。数据显示，热诱导hsp70i蛋白在缺乏基础（组成）的部分小鼠组织（心脏、肝脏、胰腺和肠道）中的水平热休克蛋白70i表达式。
图7
图7
骨髓细胞的耐热性诱导。（A） 骨髓祖细胞来自热休克蛋白70.3-或热休克蛋白70.1-缺陷小鼠表现出维持耐热性的能力下降。来自+/+（●）、+/-（▴）或−/−（▾）的骨髓细胞热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.三测试小鼠的耐热能力。在37°C下的恢复期内所示的时间，用更高的热量（44°C，40分钟）重新加热预处理过的细胞（43°C，20分钟）。随后对细胞进行铺板，以观察粒细胞、巨噬细胞或粒细胞和巨噬细胞的混合物的集落形成，在37°C下孵育8天后对其进行显微镜计数。数据表示材料和方法中描述的每个时间点的存活率。误差条表示三次重复平均值的标准误差。（B和C）骨髓细胞中热诱导hsp70i蛋白表达的动力学在热休克蛋白70.3-或热休克蛋白70.1-缺陷小鼠。骨髓细胞采集自热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.三+/+不处理、+/-或−/-小鼠，或在43°C下加热20分钟。然后在37°C下培养细胞1、2、4、6或24小时，然后用35μg总细胞蛋白进行免疫印迹收集和分析。使用的抗体显示在左侧。β-Gal是一种对β-半乳糖苷酶蛋白特异的小鼠单克隆抗体。C92识别热诱导型hsp70。3A3识别组成型和热诱导型hsp70。肌动蛋白的兔多克隆抗体被用作负荷指标。将从非热处理细胞中提取的蛋白质作为对照（显示为C）。请注意，在热休克蛋白70.1−/−骨髓细胞中仍有hsp70蛋白带。这代表hsp70.3蛋白；反之亦然热休克蛋白70.三−/−老鼠。
图8
图8
两者的累积表达热休克蛋白70热休克后的基因对于最大程度的耐热性发育和维持至关重要。（A） 停用热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.3基因导致MEF获得性耐热性维持不足。为了诱导热耐受性，MEF用相对温和的热休克（43℃持续20分钟）进行预处理，并在37℃下恢复6或24小时，然后用致命热休克（45℃持续30分钟）进行激发。在37°C下进一步恢复24小时后，通过膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶染色以及荧光激活细胞分选仪进行分析。根据染色曲线（膜联蛋白和碘化丙啶双阴性）计算热处理细胞群的细胞存活百分比。填充条，控制MEF；散列条，热休克蛋白70.3−/−MEF；开放式酒吧，热休克蛋白70.1−/−MEF公司。（B） 暴露于热休克蛋白70.1-或热休克蛋白70.3-亚致死热休克的MEF缺乏导致hsp70i表达诱导显著降低。来自+/+、+/-或−/−的MEF热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.三对小鼠进行热处理（43°C持续20分钟），并在37°C下恢复指定时间后提取蛋白质。用hsp70i（C92）特异性抗体免疫印迹法检测hsp70i蛋白表达。将从非热处理细胞中提取的蛋白质作为对照（显示为C）。热休克蛋白70.三或热休克蛋白70.1通过β-半乳糖苷酶蛋白分析检测转录活性，并使用肌动蛋白作为负荷指标，如材料和方法所述。（C） 停用热休克蛋白70.1和热休克蛋白70.3基因通过激活内在凋亡途径增加MEF对细胞死亡的易感性。来自+/+或−/−的MEF热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.三用相对温和的热休克（43℃持续20分钟）对小鼠进行预处理，并让其在37℃下恢复6或24小时，然后用致命的热休克进行攻击（45℃持续30分钟）。在37°C下进一步恢复24小时后进行分析，细胞色素除外c（c）在6小时恢复期后进行分析。Procaspase 9，PARP，线粒体细胞色素c（c）通过免疫印迹法检测热处理细胞的释放和肌动蛋白（作为负荷控制）。使用从未经热处理的细胞中提取的蛋白质作为对照（表示为C）。指定为45°C的通道代表从45°C加热30分钟的细胞中提取的蛋白质，无需预处理。
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