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.2001年11月；108(9):1369-78.
doi:10.1172/JCI12373。

DDR2受体促进MMP-2介导的肝星状细胞增殖和侵袭

E奥拉索 1, 池田K, F J工程师, L Xu先生, L H王, H C林, S·L·弗里德曼
附属公司

DDR2受体促进MMP-2介导的肝星状细胞增殖和侵袭

E奥拉索等。 临床研究杂志. 2001年11月.

摘要

I型胶原通过尚不清楚的机制在肝损伤期间激活肝星状细胞。在这里，我们测试了盘状结构域酪氨酸激酶受体2（DDR2）在该途径中的作用，该受体是对I型胶原的反应信号。DDR2 mRNA和蛋白在原代培养激活的星状细胞或肝损伤期间在体内诱导。受体对内源性或外源性I型胶原的反应是酪氨酸磷酸化的，而在基质胶上生长诱导的细胞静止期间，其表达下调。我们建立了稳定过度表达野生型DDR2、组成活性嵌合DDR2受体（Fc-DDR2）、表达胞外结构域的截短受体或激酶头DDR2的星状细胞系。过度表达DDR2的细胞通过Matrigel、，与活性基质金属蛋白酶2（MMP-2）表达增加直接相关的活性。这些数据表明，DDR2是在星状细胞激活过程中诱导的，并暗示磷酸化受体是MMP-2释放和生长刺激的介质，以响应I型胶原。此外，I型胶原依赖性DDR2表达的上调在活化的星状细胞中建立了正反馈回路，导致进一步的增殖和增强的侵袭活性。

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图1
图1
DDR2是在体外星状细胞激活过程中诱导的。从正常大鼠肝脏分离的星形胶质细胞在单层培养中保持8天，并分析DDR2 mRNA和蛋白。(一)Northern blot分析使用与DDR2和GAPDH cDNA杂交的星形细胞原代培养物中的10μg mRNA进行。(b条)基于以下数据的汇总直方图显示了体外培养星状细胞激活期间DDR2的诱导一结果表示为DDR2 mRNA与GAPDH mRNA的比值(c（c）)星形细胞培养0、2和8天，在RIPA缓冲液中溶解，免疫沉淀，免疫印迹，并用多克隆抗DDR2 Ab R2-JM进行探测。COS-1细胞转染全长DDR2（+）或空载体（-）。(d日)通过Western blot分析裂解产物中的微管蛋白，作为蛋白质负荷的对照。
图2
图2
DDR2在肝损伤期间在星状细胞中诱导。(一)单剂量CCl对大鼠星状细胞DDR2 mRNA表达的Northern blot分析4或胆管结扎后。(b条)显示肝损伤期间DDR2诱导的汇总直方图。结果在直方图中表示为DDR2 mRNA与GAPDH mRNA的比值(c（c）)CCl治疗4周的大鼠肝总提取物4或单独在RIPA缓冲液中裂解玉米油载体。用R2-JM抗体免疫沉淀DDR2，然后用抗磷酸酪氨酸抗体（4G10）或抗DDR2抗体R2-JM.进行Western blot分析。
图3
图3
I型胶原刺激星状细胞中的DDR2磷酸化。用10μg/ml I型胶原刺激HSC-T6星状细胞以增加间隔，并在RIPA缓冲液中溶解。用抗DDR2抗体R2-JM免疫沉淀DDR2，然后用抗磷酸酪氨酸抗体（4G10）或抗DDR2（R2-JM）进行Western blot分析。
图4
图4
内源性胶原蛋白合成足以实现DDR2磷酸化。HSC-T6星状细胞在脯氨酸类似物存在下培养48小时顺式-OH-Pro可减少胶原蛋白合成。(一)使用多克隆抗体通过细胞裂解物的蛋白质印迹分析I型胶原的水平(b条)用多克隆抗DDR2抗体R2-JM免疫沉淀细胞裂解物，然后用抗磷酸酪氨酸抗体（4G10）或抗DDR2（R2-JM）进行蛋白质印迹分析。
图5
图5
细胞外基质调节DDR2的表达。DDR2 mRNA水平(一)和蛋白质(b条)在Matrigel或I型胶原凝胶上生长3天后，分析永生化HSC（HSC-T6）表达的蛋白。作为负荷对照，分别评估Tubulin或GAPDH mRNA表达水平。(c（c）)通过Western blot分析评估，在通过塑料原代培养激活的原代星状细胞中，转移到Matrigel导致培养48小时后DDR2表达减少。
图6
图6
DDR2促进HSC增殖。HSC-T6细胞感染含有双顺反子cDNA的逆转录病毒，该cDNA表达缺失激酶结构域受体的截短型（ec-DDR2）、激酶突变体（kd-DDR2）、GFP（对照）或组成活性DDR2受体（Fc-DDR2）。利用FACS通过细胞分选GFP荧光回收感染细胞。(一)逆转录病毒感染kd-DDR2可抑制内源性DDR2受体的磷酸化，以应对暴露于10μg/ml I型胶原30分钟的反应(b条) [三H] -胸腺嘧啶掺入或(c（c）)细胞数量，并表示为与对照细胞的相对值。
图7
图7
DDR2促进星状细胞中MMP-2的表达和活性。在三个重复的实验中分析了HSC-T6细胞的无血清上清液，这些上清液表达受体激酶缺失突变（kd-DDR2）、GFP单独（对照）或组成活性Fc-DDR2(一)使用Western blots和(b条)明胶酶谱法测定MMP-2活性。相对表达通过NIH Image软件进行定量，并显示在每个泳道下方。
图8
图8
增加TIMP-2或MMP抑制剂GM6001是抑制过度表达DDR2的星状细胞增殖所必需的。(一)单独表达GFP（对照）或组成活性Fc-DDR2的HSC-T6细胞在含有1%FCS的DMEM中，在重组TIMP-2或GM6001，10μM（GM）的存在下培养48小时。成立[三H] -在实验的最后6小时内测量胸腺嘧啶。(b条)通过Western blots分析无血清上清液或HSC-T6细胞裂解液中TIMP-2和MT1-MMP的表达（对照组）或Fc-DDR2。
图9
图9
DDR2促进星状细胞侵入基底膜基质，并被GM6001抑制。(一)感染ec-DDR2、kd-DDR2、GFP单独（对照）、wt-DDR2或组成活性Fc-DDR2的HSC-T6细胞的代表性实验悬浮在DMEM加1%FCS中，并放置在100μg/cm涂层的插入物（8μm孔径）上2Matrigel的。从Kupffer细胞培养物中提取的条件培养基补充1%FCS用作化学引诱剂。12小时后，用0.2%结晶紫对粘附在膜下侧的迁移细胞进行染色，并在每个插入物的10个随机高功率场中计数。填充柱表示用20μM GM6001预处理1小时的HSC-T6细胞迁移，然后允许在10μM GM600存在下迁移。12小时后迁移至下腔的对照细胞数量为每高功率场55±6个。(b条)HSC-T6细胞通过无涂层插入物迁移4小时的典型实验。迁移至下腔的对照HSC-T6细胞数量为293±80个/高功率场。
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