SMN interacts with a novel family of hnRNP and spliceosomal proteins

doi:10.1093/emboj/20.19.5443

.2001年10月1日；20(19):5443-52.

doi:10.1093/emboj/20.19.5443。

SMN与hnRNP和剪接体蛋白的新家族相互作用

Z穆拉托斯¹, 阿贝尔, J Yong先生, N片冈, G德雷福斯

附属公司

PMID： 11574476
预防性维修识别码：项目经理125643
DOI（操作界面）： 10.1093/emboj/20.19.5443

SMN与hnRNP和剪接体蛋白的新家族相互作用

Z穆拉托斯等。欧洲工商管理硕士J. 2001.

.2001年10月1日；20(19):5443-52.

doi:10.1093/emboj/20.19.5443。

作者

Z穆拉托斯¹, 阿贝尔, J Yong先生, N Kataoka北部, G德雷福斯

附属

¹美国宾夕法尼亚大学医学院生物化学与生物物理系霍华德·休斯医学研究所，费城，宾夕法尼亚州19104-6148。

PMID： 11574476
预防性维修识别码：项目经理125643
DOI（操作界面）： 10.1093/emboj/20.19.5443

摘要

脊髓性肌萎缩（SMA）是一种常见的神经退行性疾病，由运动神经元（SMN）存活蛋白的缺失或功能丧失突变引起。SMN与Gemin2、Gemin3和Gemin4等多种蛋白质组成复合物，在小核核糖核蛋白（snRNP）的生物生成和前mRNA剪接中起重要作用。在这里，我们描述了三种新的hnRNP蛋白，统称为hnRNP Qs，它们来自单个基因的选择性剪接。hnRNP Q蛋白与SMN相互作用，在SMA患者中发现的最常见的SMN突变体在与SMN的相互作用中存在缺陷。我们进一步证明，hnRNP Qs是体外高效前mRNA剪接所必需的。hnRNP Q蛋白可能在SMN复合体和剪接之间提供分子连接。

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数字

**图2。**单克隆抗体18E4的性质。(一个)18E4在HeLa细胞总裂解物的western blot上识别与hnRNPs Q1、Q2、Q3和R（如图所示）相对应的四条带。分子量标记（kDa）显示在左侧。(B类)使用18E4对HeLa细胞进行激光共焦间接免疫荧光成像。(C类)指示蛋白质的免疫沉淀，由*在体外*翻译并标记为[³⁵S] 蛋氨酸，在严格的条件下（1%Empigen）用单克隆抗体18E4进行检测；免疫沉淀蛋白用SDS-PAGE溶解并用荧光法检测。标记总数的车道包含用于免疫沉淀的输入部分的10%。在一些*在体外*翻译多肽是由于异常的翻译起始。

**图3。**(一个)hnRNP Qs和R是hnRNP复合体的一部分，并形成不同的hnRNP亚复合体。用抗hnRNP C1/C2（4F4）、hnRNP Q1、Q2、Q3和R（18E4）或SP2/0抗体对HeLa细胞总裂解液进行免疫沉淀（IP），作为阴性对照。免疫沉淀用抗hnRNP A1的单克隆抗体18E4、4F4和4B10进行免疫印迹分析。Total（T）显示了IP所用输入的～3%。(B类)在hnRNP复合物的2D图谱上，将hnRNP Q亚型分配为hnRNP Q1、Q2和Q3。用抗hnRNP C1/C2（IP，anti-hnRNP C1/C2）单克隆抗体4F4免疫纯化hnRNP复合物[³⁵S] 用二维非平衡pH梯度凝胶电泳（2D-NEPHGE）对蛋氨酸标记的HeLa细胞进行分析。第一维是肾，第二维是SDS–PAGE（11.5%聚丙烯酰胺）。分子量标记（kDa）显示在左侧。体外翻译和[³⁵S] 蛋氨酸标记的hnRNP Q亚型(*在体外*翻译），并在相同条件下在单独的凝胶上进行类似分析；hnRNP蛋白被标记。

**图4。**hnRNP Qs与SMN的相互作用*在体外*和体内; 最小SMN结合域的鉴定和hnRNP R与hnRNP Q3的相互作用。(一个)结合分析中使用的hnRNP Q1野生型和缺失突变体的示意图和最小SMN结合域的氨基酸序列。数字是指氨基酸。灰色区域表示RGG框。氨基酸以单字母代码表示；RG二肽和RGG序列突出显示。(B类)指示的蛋白质由*在体外*翻译，标记为[³⁵S] 蛋氨酸并与重组GST-SMN孵育；结合蛋白通过SDS-PAGE和荧光分析进行分析。(C类) 体外翻译和[³⁵S] 蛋氨酸标记的SMN与融合到hnRNP Q1[GST–Q1（RGG）]RGG结构域的重组GST或与GST孵育；结合蛋白分析如上。标记为total的车道包含用于绑定的输入分数的10%。(D类)与SMN相关的hnRNP Q1、Q2、Q3和R体内用抗SMN（α-外显子7）或SP2/0抗体作为阴性对照，对HeLa细胞总裂解液进行免疫沉淀（IP）。免疫沉淀物用抗hnRNPs Q1、Q2 Q3和R的单克隆抗体18E4进行western blotting分析。Total（T）显示用于IP的输入量为～3%。(E类)hnRNP R蛋白由*在体外*翻译，标记为[³⁵S] 蛋氨酸，与重组GST–hnRNP Q3孵育；结合蛋白分析如上所述；total是指用于绑定的输入部分的10%。在一些*在体外*翻译多肽是由于异常的翻译起始。

**图5。**SMN的C末端结构域是与hnRNP Q1结合所必需的，SMNΔEx7是SMA患者中发现的最常见的突变，显示出与hnRNPQ1有缺陷的相互作用。体外翻译和[³⁵S] 用重组GST–hnRNP Q1孵育蛋氨酸标记的野生型SMN和myc标记的N末端（SMNΔN91）或C末端（SMMΔY/G和SMN△Ex7）SMN缺失。结合蛋白通过SDS-PAGE解析并通过荧光检测。SMNΔY/G迁移较慢是由于其在SDS-PAGE凝胶上的异常电泳行为。在C-末端myc标记的SMN缺失蛋白中出现的双重性是由于利用了两个翻译起始位点，一个来自myc表位，另一个来自SMN的第一密码子。

**图6。**hnRNP Qs与前mRNA、内含子RNA中间产物和mRNA相关。³²P标记Ad2(一个)，CDC公司(B类)或CDC-2(C类)前mRNA在剪接条件下与HeLa细胞核提取物孵育。在用抗hnRNP Qs和R抗体（18E4）、抗hnRNP-C1/C2抗体（4F4）和抗T7标记抗体（T7）免疫沉淀后，作为阴性对照，在10%（A和B）或6%（C）变性聚丙烯酰胺凝胶上分析残留RNA。标记为T的通道（总计）包含5%的输入RNA。标记为M的通道包含³²P标记的pBR322/*消息传递程序*I标记。RNA产物以示意图形式显示在右侧。外显子以方框表示，内含子以线条或套索表示。CDC-2前mRNA（C）的产物和剪接中间体的命名基于先前的特征（Ohno等人，1987年）。

**图6。**hnRNP Qs与前mRNA、内含子RNA中间产物和mRNA相关。³²P标记Ad2(一个)、疾病预防控制中心(B类)或CDC-2(C类)前mRNA在剪接条件下与HeLa细胞核提取物孵育。在用抗hnRNP Qs和R抗体（18E4）、抗hnRNP C1/C2抗体（4F4）和抗T7标签抗体（T7）作为阴性对照进行免疫沉淀后，在10%（A和B）或6%（C）变性聚丙烯酰胺凝胶上分析保留的RNA。标记为T的通道（总计）包含5%的输入RNA。标记为M的通道包含³²P标记的pBR322/*消息传递程序*我标记。RNA产物以示意图形式显示在右侧。外显子以方框表示，内含子以线条或套索表示。CDC-2前mRNA（C）的产物和剪接中间体的命名基于先前的特征（Ohno等人，1987年）。

**图7。**(一个)HeLa核提取物（HNE）中hnRNPs Q1、Q2、Q3和R的特异性免疫耗竭。用SDS-PAGE分离等量的天然（HNE）、SP2/0模拟缺失（HNE-mock）或单克隆抗体18E4（HNE-ΔQs/R）提取物缺失，然后用所示抗体进行免疫印迹。HnRNPs Q1、Q2、Q3和R在经过18E4（HNE-ΔQs/R）处理的核提取物中被专门耗尽；其他hnRNP蛋白（hnRNP K）或SMN的水平基本上保持不变。(B类)用免疫亲和色谱法纯化hnRNP Qs和R。总HeLa细胞裂解物通过含有共价偶联18E4（针对hnRNPs Q1、Q2、Q3和R）或SP2/0（阴性对照）的柱。在大量洗涤后，用低pH值洗脱结合蛋白，立即中和并在缓冲液D（不含甘油）中透析。用SDS-PAGE分离洗脱液（18E4和SP2/0）中的等分样品，并用银染色进行可视化。标记为18E4的通道含有1µg总蛋白。hnRNPs Q1、Q2、Q3和R仅存在于18E4洗脱液中。

**图8。**高效的前mRNA剪接需要hnRNP Qs。体外拼接反应使用³²使用已耗尽hnRNP Q1、Q2、Q3和R（HNE-ΔQs/R）或已模拟耗尽（HNE-mock）的HeLa核提取物进行P标记的CDC和Ad2前mRNA。图中还显示了剪接反应中使用的25%的输入前体mRNA（但不受剪接影响）（T）。在(一个)在剪接之前，将约400ng从含有18E4的柱（18E4洗脱液）获得的免疫纯化的hnRNP Q1、Q2、Q3和R的总蛋白，或从含有SP2/0的柱（SP2/0洗脱液）获得的等体积洗脱液，如图所示添加到核提取物中。在(B类)如图所示，将免疫纯化的hnRNP Q1、Q2、Q3和R（18E4洗脱液）的总蛋白添加到核提取物中，添加量为～100或～400 ng。剪接后，在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上分析RNA产物。标记为M的车道包含³²P标记的pBR322/*消息传递程序*我标记。CDC前mRNA和Ad2前mRNA的RNA产物示意图分别显示在左侧和右侧。外显子表示为方框，内含子表示为线或套索。(C类)（A）中所示数据的量化。将所示提取物中剪接的相对效率与模拟缺失提取物（HNE-mock）的剪接相对效率进行了比较，后者被任意设置为1.0。白色条代表使用Ad2-pre-mRNA的剪接反应数据，黑色条代表来自CDC pre-mRNA的数据。定量分析按指示进行（材料和方法）。

**图8。**高效的前mRNA剪接需要hnRNP Qs。体外拼接反应使用³²使用已耗尽hnRNP Q1、Q2、Q3和R（HNE-ΔQs/R）或已模拟耗尽（HNE-mock）的HeLa核提取物进行P标记的CDC和Ad2前mRNA。还显示了用于剪接反应（但未进行剪接）的输入前mRNA的25%（T）。在(一个)如图所示，在剪接之前，将从含有18E4的色谱柱（18E4洗脱液）中获得的免疫纯化hnRNP Q1、Q2、Q3和R的总蛋白或从含有SP2/0的色谱柱中获得的等量洗脱液（SP2/0洗脱物）添加到核提取物中。在(B类)如图所示，将免疫纯化的hnRNP Q1、Q2、Q3和R（18E4洗脱液）的总蛋白添加到核提取物中，添加量为～100或～400 ng。剪接后，在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上分析RNA产物。标记为M的车道包含³²P标记的pBR322/*消息传递程序*我标记。CDC前mRNA和Ad2前mRNA的RNA产物示意图分别显示在左侧和右侧。外显子表示为方框，内含子表示为线或套索。(C类)（A）中所示数据的量化。将所示提取物中剪接的相对效率与模拟缺失提取物（HNE-mock）的剪接相对效率进行了比较，后者被任意设置为1.0。白色条表示使用Ad2 pre-mRNA剪接反应的数据，黑色条表示CDC pre-mRNA的数据。按照指示进行定量分析（材料和方法）。

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1. Burge C.B.、Tuschl，T.和Sharp，P.A.（1999）通过剪接体将前体剪接到mRNA。在Gesteland，R.F.、Cech，T.R.和Atkins，J.F.（eds）的《RNA世界》中。第2版。冷泉港实验室出版社，纽约州冷泉港，第525-560页。
1. Burghes A.H.M.（1997）何时删除不是删除？当它被转换时。Am.J.Hum.遗传学。，61, 9–15.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Chan R.C.和Black，D.L.（1997）多嘧啶束结合蛋白结合神经细胞特异性C-src外显子N1上游，以抑制下游内含子的剪接。分子细胞。生物学，174667-4676。-项目管理咨询公司-公共医学
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[4] Burge C.B.、Tuschl，T.和Sharp，P.A.（1999）通过剪接体将前体剪接到mRNA。在Gesteland，R.F.、Cech，T.R.和Atkins，J.F.（eds）的《RNA世界》中。第2版。冷泉港实验室出版社，纽约州冷泉港，第525-560页。

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