跳到主页面内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2001年10月；75(19):9415-26.
doi:10.1128/JVI.75.19.9415-9426.2001。

淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒（LCMV）的环指Z蛋白抑制LCMV S段小基因组的转录和RNA复制

T I Cornu公司 1, 托雷球场
附属公司

淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒（LCMV）的环指Z蛋白抑制LCMV S段小基因组的转录和RNA复制

T I Cornu公司等。 J维罗尔. 2001年10月.

摘要

沙粒病毒有一个二分的负链RNA基因组，其蛋白质组学能力仅限于四种多肽，即核蛋白（NP）、表面糖蛋白（GP）（通过蛋白质水解加工为GP1+GP2）、聚合酶（L）和小（11-kDa）环指蛋白（Z）。Z在淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒（LCMV）生命周期中的作用尚不清楚。我们利用原型沙粒病毒LCMV的反向遗传系统研究了Z在病毒转录和复制中的功能。该系统包括LCMV微基因组和从分离的共转染质粒表达的最小病毒转染因子（NP和L）。共转染Z cDNA强烈抑制LCMV微基因组表达。需要合成Z蛋白的效果；其大小与剂量有关，并且Z蛋白水平显著低于LCMV感染细胞中观察到的水平。Z的共表达并没有阻止质粒提供的小基因组的包被，但它同样影响转录和RNA复制。Z中打开其环指结构域的突变消除了其抑制活性，但与Z无关的环蛋白并不影响LCMV微基因组的表达。与微基因组结果一致，瞬时表达Z的细胞对LCMV感染的敏感性降低。

PubMed免责声明

数字

图1
图1
LCMV Z通过LCMVSCAT2小基因组以剂量依赖的方式抑制CAT表达。BHK-21细胞感染vTF7.3（MOI=3），随后与0.5μg pLCMVSCAT2、1.5μg pCITE-NP、0.1μg pGEM-L、0.1μgpTMI-GFP共转染，并增加pUCIRES-Z的数量，如图所示。质粒pGEM-L未添加到通道8中。在所有样品中，通过添加适量的质粒pTMI，DNA总量保持不变（2.7μg）。pTMI-GFP的使用使我们能够基于GFP阳性细胞的数量、用于CAT测定的细胞的先前收获和蛋白质表达分析来确定转染的效率。（A） LCMVSCAT2小基因组表达。在转染后24小时，制备细胞裂解物以测量CAT活性，如材料和方法中所述。（B） Z蛋白表达。对细胞裂解液进行SDS-PAGE，并使用兔抗Z抗体通过Western blot测定Z蛋白表达水平。1号通道中的裂解液是在24 h p.i.感染LCMV（MOI=3）的细胞中制备的。Z蛋白的位置显示在右侧，分子大小标记显示在左侧。O、 起源；Cm，氯霉素；MAc，单乙酰化氯霉素；DAc，二乙酰化氯霉素。
图2
图2
Z质粒的抑制作用需要Z蛋白的合成。（A） Z-wt和Z-stop突变体之间的核苷酸序列差异。Z-stop突变体包含插入ATG起始密码子下游的两个终止密码子（带下划线）。在Z停止结构中插入一个额外的A（✽）创建了下游阅读框的移码。（B） Z-stop突变体无法产生Z蛋白。用vTF7.3（MOI=3）感染BHK-21细胞，并转染0.5μg pUCIRES-Z或0.5μg p UCIRESZ-stop。转染24小时后制备裂解液并进行SDS-PAGE。用兔Z抗血清进行Western blotting检测Z蛋白的表达。Z蛋白的位置显示在右侧，分子大小标记显示在左侧。（C） Z-stop突变体不通过LCMVSCAT2微基因组抑制CAT活性。用vTF7.3（MOI=3）感染BHK-21细胞，并与0.5μg pLCMVSCAT2、1.5μg pCITE-NP、0.1μg pGEM-L、0.1μgpTMI-GFP共转染，如图所示，增加pUCIRES-Z或pUCIRESZ-stop的数量。质粒pGEM-L未添加到通道12中。通过将质粒pTMI添加到2.7μg，所有样品中的DNA量保持不变。转染后24小时，按照材料和方法中的描述，对样品进行CAT活性分析。O、 起源；Cm，氯霉素；MAc，单乙酰化氯霉素；DAc，二乙酰化氯霉素。
图3
图3
Z蛋白的表达不影响NP或L的质粒衍生表达。在SDS-10%PAGE凝胶上分离等量的细胞裂解物以检测NP和L蛋白的表达，或在SDS-16%PAGE凝胶上分离等量的细胞裂解物以检测Z蛋白的表达。泳道2至5和泳道8至11中的裂解物由用vTF7.3（MOI=3）感染的细胞制备，并用1μg pCITE NP和1μg pGEM-L转染。共转染的pUCIRES-Z的量显示在顶部。从模拟感染细胞制备的裂解液装载在通道6和12中，而LCMV感染细胞的裂解液则装载在通道1和7中。L、NP和Z蛋白的位置显示在右侧，分子大小标记显示在左侧。与之前的研究结果一致，在LCMV感染细胞的细胞裂解液中未通过Western blotting检测到L蛋白（33）。
图4
图4
LCMV RNP的生化和生物学特性。（A）与LCMV RNA相关的Z水平。从模拟细胞（1和2道）和LCMV感染细胞（3和4道）制备全细胞提取物（1和3道）和RNP（2和4道。车道4中的RNP装载量相当于车道3中装载量的六倍（小区当量）。（B） LCMV RNP的感染性。用模拟和LCMV感染细胞制备的RNP转染细胞。作为对照，细胞也被LCMV或模拟感染。在48小时p.i.或转染后，用LCMV的豚鼠多克隆抗血清固定细胞并进行免疫荧光分析。通过斑块测定法测定相应上清液（48小时p.i.）中感染性LCMV的水平（18）。（C） 与LCMV RNP相关的传染性特征。使用NP-40（0.05%，在冰上15分钟）或胰腺RNase（25μg，在20°C下30分钟）处理LCMV的RNP（1至4道）或病毒（5至10道），或不进行治疗。通过直接菌斑试验（P）或转染试验（T）检测与治疗和未治疗病毒和RNP相关的感染性。RNP相关感染性归一化为未经处理的RNP转染获得的感染性。病毒相关感染性标准化为未处理病毒的直接菌斑试验获得的感染。进行了三次独立的分析。显示了平均值和标准偏差。
图5
图5
LCMV感染自然过程中Z表达的动力学。（A） Z mRNA合成动力学。用LCMV感染BHK-21细胞（MOI=3），并用Northern blot杂交分析在指定时间点分离的细胞总RNA。对于每个时间点，在两个不同的凝胶中装载等量的RNA。在两种凝胶中，第7通道都对应于模拟感染细胞的RNA。两种凝胶的Northern blot分析过程相同。一个膜用于检测Z mRNA和L片段[32P] dCTP标记的Z-DNA探针（面板i）。另一个膜用于检测NP mRNA和S段，使用[32P] dCTP标记的NP-DNA探针（第三组）。分子标记显示在右侧。杂交之前，用亚甲基蓝对每个膜进行染色，以根据28S和18S RNA的水平评估每个样品中的RNA总量（第二和第四组）。（B） Z蛋白表达动力学。BHK-21细胞感染LCMV（MOI=3），并在指定的时间点采集。对细胞裂解物进行SDS-PAGE，并用兔抗Z抗体进行Western blotting分析Z蛋白的表达。1号通道对应于模拟感染细胞。
图6
图6
Z对LCMV S片段小基因组的包壳化和RNA合成的影响。（A） Z不抑制质粒提供的LCMVSCAT2小基因组的包壳作用。（i） BHK-21电池（106用vTF7.3（MOI=3）感染细胞/孔，6孔板），并联合转染0.5μg pLCMVSCAT2、1.5μg pCITE-NP、0.1μg pGEM-L和0.1μg p TMI-GFP。表达L和NP的质粒分别在通道7和通道8中被省略。来自通道1至3的样品也转染了100 ng的pUCIRES-Z。在所有样品中，通过添加质粒pTMI，DNA量保持不变（2.7μg）。转染后24小时，收集细胞（三孔/样品），并按照材料和方法中的描述获得RNP。分离封装RNA，并通过减少输入RNA的数量进行半定量RT-PCR：总RNA的1/4、1/8和1/16用于1至3车道和4至6车道。在通道7和8中，总RNA的1/8被扩增。在通道9中，分析了总RNA的1/4，省略了RT步骤，作为RNP制剂中质粒DNA污染的控制。分子大小标记显示在左侧。MG指微基因组LCMVSCAT2。（ii）从LCMV感染的BHK-21细胞（3×106（MOI=3）。按照材料和方法中的描述，通过半定量RT-PCR分离和分析封装RNA。在这种情况下，用于PCR的引物扩增了与NP序列对应的S片段的一个片段（约350 bp）。（B） Z蛋白对LCMV聚合酶介导的RNA合成的影响。用vTF7.3（MOI=3）感染BHK-21细胞，并用0.5μg pLCMVSCAT2、1.5μg pCITE-NP、0.1μg pGEM-L、0.1μgpTMI-GFP和增加的pUCIRES-Z共同转染。质粒pGEM-L未添加到通道7中。分离细胞总RNA，并通过Northern杂交分析等量（5μg）。（i） 亚基因组CAT mRNA和全长抗原RNA物种用[32P] UTP AS CAT核糖探针。分子大小标记显示在左侧。（ii）对膜进行亚甲蓝染色，以确定28S和18S RNA的位置和水平。
图7
图7
环指基序的破坏将取消Z蛋白的抑制作用。（A） 突变体Z-F32G35的环结构域中引入的氨基酸变化。环指突变体F32G35在密码子位置32和35处包含两个核苷酸变化，分别通过将氨基酸残基从C变为F和从C变为了G来破坏环指基序。（B） 环指突变体Z F32G35稳定表达。用vTF7.3（MOI=3）感染BHK-21细胞，并转染指定数量的pUCIRES-Z或pUCIRES Z-F32G35质粒DNA。7号通道显示模拟转染细胞的结果。裂解产物进行SDS-PAGE，用兔抗Z抗体进行Z蛋白免疫检测。Z的位置显示在右侧，分子大小标记显示在左侧。（C） 突变体Z-F32G35不抑制LCMVSCAT2微基因组介导的CAT活性。BHK-21细胞单层感染vTF7.3（MOI=3），并与0.5μg pLCMVSCAT2、1.5μg pCITE-NP、0.1μg pGEM-L、0.1μgpTMI-GFP共转染，pUCIRES-Z和pUCIRESZ-F32G35的数量增加，如底部所示。质粒pGEM-L未添加到通道8中。在所有样品中，通过添加质粒pTMI至2.7μg，DNA量保持不变。如材料和方法中所述，对样品进行CAT活性测定。O、 起源；Cm，氯霉素；MAc，单乙酰化氯霉素；DAc，二乙酰化氯霉素。
图8
图8
LCMVSCAT2微基因组表达不受与Z无关的环指蛋白的抑制。（A）病毒（Vmw110和IE86）和细胞（PML）环指蛋白在BHK细胞中的表达。BHK-21细胞感染vTF7.3（MOI=3），并转染0.5μg RMX-PML（第i组，第3区）、0.5μg pT7-110（第ii组，第4区）或0.5μg gpGEM-IE86（第ii区）。蛋白质表达通过Western blotting用兔抗PML抗体（第i组，1至3道）或小鼠抗Vmw110抗体（第1组，4至6道）或免疫荧光用小鼠抗IE86抗体（第ii组）进行分析。PML和Vmw110的位置显示在右侧，分子尺寸标记显示在左侧。（B） 未观察到LCMVSCAT2小基因组对CAT表达的抑制作用与Z无关的环指蛋白。BHK-21细胞与0.5μg pLCMVSCAT3、1.5μg pCITE-NP、0.1μg pGEM-L、0.1μg/pTMI-GFP共转染，如图底部所示，pUCIRES-Z、pGEM-IE86、pT7-110或RMX-PML数量增加。质粒pGEM-L在泳道14中被省略。通过将载体pTMI添加到2.7μg，所有样品中的DNA量保持不变。按照材料和方法中的描述，对样品进行CAT活性分析。O、 起源；Cm，氯霉素；MAc，单乙酰化氯霉素；DAc，二乙酰化氯霉素。
图9
图9
vTF7.3介导的Z表达对LCMV感染的影响。（A） vTF7.3介导的Z和ChRb表达对LCMV和VSV感染的影响。BHK-21细胞感染vTF7.3（MOI=3），随后转染ChRb（a、f、d和i）、Zwt（b、g、e和j）或ZF32G35（c和h），并感染LCMV（MOI=3）（a到c和f到h）或VSV（MOI=3）（d、e、i和j）。分别在12和24 h p.i.用VSV和LCMV固定细胞，并使用指示的一级抗体以及与FITC或TXR偶联的适当二级抗体进行免疫荧光分析。（B） A组显示的免疫荧光结果的定量。在每种情况下，至少统计100个阳性转染细胞，并测定表达相应病毒抗原的细胞百分比。（C） vTF7.3感染对LCMV RNA合成的影响。细胞仅感染了LCMV（第2和第3道）或同时感染LCMV和vTF7.3（第4和第5道）。在指定的p.i.时间，使用LCMV NP探针制备RNA并通过Northern印迹分析。（D） vTF7.3感染对LCMV抗原表达的影响。细胞感染LCMV或与LCMV+vTF7.3复合感染。24小时后，固定细胞，并使用LCMV的豚鼠多克隆抗血清进行免疫荧光检查。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

  • 进入抑制剂作为沙粒病毒抗病毒药物。
    Iyer K、Yan Z、Ross SR。 Iyer K等人。 前微生物。2024年4月8日；15:1382953. doi:10.3389/fmicb.2024.1382953。eCollection 2024年。 前微生物。2024 PMID：38650890 免费PMC文章。 审查。
  • 替代翻译有助于产生抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活和先天免疫的朱宁病毒核蛋白的细胞质亚群。
    Bostedt L、Fénéant L、Leske A、Holzerland J、Günther K、Waßmann I、Bohn P、Groseth A。 Bostedt L等人。 《维罗尔杂志》。2024年2月20日；98（2）：e0197523。doi:10.1128/jvi.01975-23。Epub 2024年1月31日。 《维罗尔杂志》。2024 PMID：38294249
  • 基于质粒的拉萨病毒反向遗传学。
    Martínez-Sobrido L、Ye C、de la Torre JC。 Martínez-Sobrido L等人。 方法分子生物学。2024;2733:115-131. doi:10.1007/978-1-0716-3533-98。 方法分子生物学。2024 PMID：38064030
  • 抗沙状病毒感染候选疫苗。
    Saito T、Reyna RA、Taniguchi S、Littlefield K、Paessler S、Maruyama J。 Saito T等人。 疫苗（巴塞尔）。2023年3月13日；11(3):635. doi:10.3390/疫苗11030635。 疫苗（巴塞尔）。2023 PMID：36992218 免费PMC文章。 审查。
  • 布尼亚病毒基因组复制和转录机制。
    Malet H、Williams HM、Cusack S、Rosenthal M。 Malet H等人。 《公共科学图书馆·病理学》。2023年1月12日；19（1）：e1011060。doi:10.1371/journal.ppat.1011060。eCollection 2023年1月。 《公共科学图书馆·病理学》。2023 PMID：36634042 免费PMC文章。 审查。
查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Atreya P L，Peeples M E，Collins P L。人类呼吸道合胞病毒的NS1蛋白是小基因组转录和RNA复制的有效抑制剂。《维罗尔杂志》。1998;72:1452–1461.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Borden K L，Boddy M N，Lally J，O’Reilly N J，Martin S，Howe K，Solomon E，Freemont P S。急性早幼粒细胞白血病原癌蛋白PML的环指结构域的溶液结构。EMBO，1995年；14:1532–1541.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Borden K L，Campbell-Dwyer E J，Salvato M S.一种砂型病毒环（锌结合）蛋白结合癌蛋白早幼粒细胞白血病蛋白（PML）并将PML核体重新定位到细胞质。《维罗尔杂志》。1998;72:758–766.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Borden K L、Campbell-Dwyer E J、Carlie G W、Djavani M、Salvato M S。两种环指蛋白，即癌蛋白PML和砂状病毒Z蛋白，与核糖体P蛋白的核部分共定位。《维罗尔杂志》。1998;72:3819–3826.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Borden K L，Campbell-Dwyer E J，Salvato M S。早幼粒细胞白血病蛋白PML具有通过其RING结构域介导的促凋亡活性。FEBS信函。1997;418:30–34。-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型

物质