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.2001年9月；69(9):5698-708.
doi:10.1128/IAI.69.95698-5708.2001。

牙龈卟啉单胞菌对人冠状动脉内皮细胞自噬体的转运

B R多恩 1, 小W A Dunn, 进步盒子
附属公司

牙龈卟啉单胞菌对人冠状动脉内皮细胞自噬体的转运

B R多恩等。 感染免疫. 2001年9月.

摘要

牙龈卟啉单胞菌是一种牙周病原体，也定位于动脉粥样硬化斑块。我们以前的研究表明，牙龈卟啉单胞菌能够侵入内皮细胞，并且细胞内的细菌包含在类似于自噬体的液泡中。在本研究中，我们检测了牙龈杆菌381向自噬途径的转运。由人冠状动脉内皮细胞（HCAE）内化的牙龈假单胞菌381位于形态上与自噬体相同的空泡内。通过免疫荧光显微镜分析牙龈卟啉单胞菌381通过细胞内液泡的进展。含有牙龈假单胞菌的液泡在内化后早期与Rab5和HsGsa7p共定位。稍后，牙龈卟啉杆菌与BiP共定位，然后发展成含有BiP和溶酶体糖蛋白120的液泡。晚期内体标记物和溶酶体组织蛋白酶L与牙龈假单胞菌381没有共定位。在用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤和沃特曼预处理的HCAE细胞中，牙龈假单胞菌381的细胞内存活率在8小时后下降。此外，含有牙龈假单胞菌381的液泡中缺乏BiP，但含有组织蛋白酶L和沃特曼。这些结果表明，牙龈假单胞菌381避开了进入溶酶体的内吞途径，而是进入自噬体。

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数字

图1
图1
国际化牙龈假单胞菌HCAE细胞中。HCAE细胞被感染牙龈假单胞菌在存在（A、C和D）和不存在（B）沃特曼的情况下。感染90分钟后，牙龈假单胞菌在HCAE细胞（A）细胞质内的液泡中可见。这些液泡由一个或两个膜（箭头所示）结合，并含有未降解的小泡和细胞质基质（C和D）。沃特曼处理的HCAE细胞感染30分钟后，牙龈假单胞菌似乎处于降解过程中，位于类似溶酶体的液泡内（B）。
图2
图2
HsGsa7p和组织蛋白酶L在含有牙龈假单胞菌在HCAE细胞中使用反卷积显微镜。（A）牙龈假单胞菌与HsGsa7p共定位（箭头）。（B） 在沃特曼的存在下，牙龈假单胞菌未与HsGsa7p（箭头）共同定位。在wortmannin处理的HCAE细胞中，HsGsa7p存在于高尔基体样液泡中（箭头）。（C）牙龈假单胞菌未与组织蛋白酶L（箭头）共定位。（D）牙龈假单胞菌在沃特曼存在下与组织蛋白酶L（箭头）共定位。缩写：Gsa7p、HsGsa7p；W、 沃特曼；组织蛋白酶L；第页，牙龈假单胞菌; N、 核心。棒材，15μm。
图3
图3
BiP、LGP120、Rab5和MPR在含有牙龈假单胞菌HCAE细胞中。感染后90分钟牙龈假单胞菌（Pg）液泡含有BiP（A）和LGP120（B）（箭头所示）。（C） 感染后35分钟，牙龈假单胞菌与Rab5共定位（箭头）。（D） 在感染后2小时内观察到的大多数液泡中没有MPR（箭头表示共定位）。棒材，15μm。
图4
图4
Colocalization of牙龈假单胞菌具有自噬途径的蛋白标记。HCAE细胞与牙龈假单胞菌在没有（固体棒）和有（开放棒）10 nM麦芽甘露的情况下，381次，持续15到120分钟。数据表示牙龈假单胞菌含有BiP（A）、HsGsa7p（B）、LGP120（C）和组织蛋白酶L（D）的液泡，表示为平均值+标准偏差（误差线）。数据表明牙龈假单胞菌液泡首先获得HsGsa7p，然后获得BiP和LGP120；然而，液泡不能获得组织蛋白酶L。在沃特曼存在下，液泡不获得HsGsa7p或BiP，而是迅速获得组织酶L。沃特曼在每个时间点的效果由Student’st吨利用Bonferroni修正进行测试。当达到统计显著性（*）时P（P）小于0.01。
图5
图5
Colocalization of牙龈假单胞菌具有内吞途径的蛋白标记。HCAE细胞与牙龈假单胞菌在没有（固体棒）和有（开放棒）10 nM麦芽甘露的情况下，381次，持续15到120分钟。数据表示牙龈假单胞菌包含Rab5（A）和MPR（B）的空泡，表示为平均值+标准偏差（误差条）。数据表明牙龈假单胞菌液泡早期获得Rab5，但未获得晚期内吞标记物MPR。在有沃特曼的情况下牙龈假单胞菌液泡获得MPR。沃特曼在每个时间点的效果由Student’st吨利用Bonferroni校正进行测试。当达到统计显著性（*）时P（P）小于0.01。
图6
图6
的持久性牙龈假单胞菌在HCAE细胞内培养8小时以上。在37°C下，用新鲜的无抗生素EGM-2（实心条）、10 mM 3-甲基腺嘌呤（开放条）或10 nM沃特曼（方格条）将HCAE电池预培养1小时(n个=3）。牙龈假单胞菌381个细胞与EGM-2孵育，分别加入或不加入适当的抑制剂。感染HCAE细胞的CFU数牙龈假单胞菌在缺乏自噬抑制剂的情况下，细胞在8小时内生长，而感染HCAE细胞的CFU数量牙龈假单胞菌在存在任何一种自噬抑制剂的情况下，在8小时内CFU数量下降大肠杆菌MC1061，阴性对照，感染后2.5小时<200(n个= 3).
图7
图7
的模型牙龈假单胞菌贩运HCAE细胞。牙龈假单胞菌最初在内化后的早期内体中发现。（A） 细菌促进自身进入自噬途径。这个牙龈假单胞菌含381的液泡获得BiP，随后获得LGP120。然而，该液泡在沃特曼抑制自噬后不获得组织蛋白酶L（B），牙龈假单胞菌进入内吞途径。液泡成熟为晚期内体，然后是溶酶体，其特征是存在Rap1和组织蛋白酶L。
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