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.2001年8月15日；20(16):4380-90.
doi:10.1093/emboj20.16.4380。

PDK1中的PIF-binding口袋对于激活S6K和SGK至关重要，但对于PKB来说则不然

R M Biondi公司 1, A基洛克, R A咖喱, M Deak先生, D R阿莱西
附属公司

PDK1中的PIF-binding口袋对于激活S6K和SGK至关重要，但对于PKB来说则不然

R M Biondi公司等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

PKB/Akt、S6K1和SGK是以PI 3-激酶依赖方式激活的相关蛋白激酶，以响应胰岛素/生长因子信号。激活需要在两个残基T环和疏水基序磷酸化这些激酶。PDK1通过在其T环磷酸化这些激酶来激活S6K、SGK和PKB亚型。我们证明，PDK1激酶结构域中的一个口袋，称为“PIF-结合口袋”，在PDK1介导S6K1和SGK1在其T环基序的相互作用和磷酸化中起着关键作用。我们的数据表明，S6K1和SGK1在其疏水基序处的预先磷酸化促进了它们与PDK1的PIF-结合囊的相互作用及其T环磷酸化。因此，S6K和SGK的疏水基序磷酸化将其转化为可被PDK1激活的底物。相反，PDK1对PKBalpha的磷酸化不需要PDK1的PIF-结合囊。PIF结合口袋代表蛋白激酶上的底物识别位点，该位点仅为其生理底物亚群的磷酸化所需。

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数字

无
图1。本研究中使用的野生型和突变型AGC激酶。圆圈表示T环磷酸化位点的位置，三角形表示疏水基序磷酸化位点。wt表示野生型。S6K1的C末端104残基包含一个自身抑制结构域，该结构域在S6K1-T2构造中被删除。本研究中表达的SGK1蛋白缺乏60个N端氨基酸。ΔPH-PKBα是缺乏PH结构域的PKBα突变体。ΔPH-PKBα[HM-SGK1 wt]包含PKBα的残基118–439，其与人SGK1的残基288–431融合。PKBα[HM-SGK1 S422D]包含PKBα的118–439个残基，与人类SGK1的288–431个残基融合，其中疏水基序磷酸化位点Ser422变为Asp。PKBα[HM-PRK2]和SGK1[HM-PK2]分别包含PKBα的118-425残基和SGK1的60-372残基，融合到人类PRK2的934-984残基。
无
图2。PDK1的PIF-结合囊在S6K1、SGK1和PKBα磷酸化中的作用。将指示的AGC底物与野生型GST–PDK1或突变型GST-PDK1[L155E]在镁和[γ-32P] 材料和方法中所述的ATP。通过磷酸化肽底物交叉肽（GRPRTSSFAEG）的能力评估每个AGC激酶的激活。AGC激酶底物的磷酸化在4–12%梯度聚丙烯酰胺凝胶上电泳后测定，并在磷酸成像仪上分析对应于每个底物的考马斯蓝染色带。还通过对AGC激酶进行免疫印迹来分析磷酸化，免疫印迹抗体可特异检测T环磷酸化形式的S6K1（Thr252）、SGK1（Thr256）和PKBα（Thr308）。在所用条件下，PDK1对每个底物的磷酸化与时间和添加到分析中的酶的量呈线性关系。使用至少两个单独的时间点重复进行实验。一个实验中的重复率变化不大于10%，通常小于5%。
无
图3。PIF肽对PDK1磷酸化S6K1、SGK1和PKBα能力的影响。在镁和[γ-32P] ATP如图2图例所示。
无
图4。进一步证明，PDK1激活S6K1和SGK1需要PDK1的PIF绑定袋。S6K1-T2[T412E]系列(A类)和SGK1[S422D](B类)在缺乏或存在2µM PIF肽（阴影条）或35µM PI肽（填充条）的情况下，在镁和[γ-32P] 材料和方法中所述的ATP。通过磷酸化肽-底物交叉肽（GRPRTSSFAEG）的能力评估每种底物的活化。结果显示为两个单独实验的±SEM；每次测定一式两份。
无
图5。S6K1和SGK1与PDK1的相互作用。(A类)用表达GST、野生型（wt）GST-PDK1或突变型GST-PDK1[L155E]的DNA构建物以及指示的野生型和突变型HA靶向S6K1瞬时转染293细胞。转染后36小时，细胞被裂解，GST融合蛋白通过谷胱甘肽-Sepharose珠亲和层析纯化。纯化蛋白的等分样品在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并使用抗HA抗体进行免疫印迹，以检测HA-S6K1或考马斯，以确保GST融合蛋白的类似表达。为了确定野生型和突变型S6K1的表达水平相似，在10%SDS–聚丙烯酰胺凝胶上电泳每种条件下的总293细胞裂解物（称为粗提取物）10µg，并用抗HA抗体进行免疫印迹。(B类)如上所述，除了用表达Myc-PDK1和GST-SGK1或GST-SGK1[S422D]的DNA构建物瞬时转染293个细胞外。用抗Myc抗体通过免疫印迹进行PDK1的检测。显示了每个条件的副本。在两个不同的实验中获得了类似的结果。
无
图6。来自S6K1、SGK1、PKBα和PRK2疏水基序的肽的相对亲和力。如材料和方法中所述，在BIAcore仪器上进行表面等离子体共振测量。生物素化PIF肽固定在链霉亲和素涂层传感器芯片上，在不存在或存在包含PRK2、S6K1、SGK1和PKBα疏水基序（HM）的指定浓度肽的情况下，记录与GST–PDK1的特异性相互作用。肽PIFtide（开放三角形）对应于PRK2的残基957-980；肽HM-S6K1-P（开方块）对应于S6K1的残基401–418，其中Thr412被磷酸化；肽HM-SGK1-P（倒三角形）对应于SGK1的411-428残基，其中Ser422被磷酸化；肽HM-PKBα-P（开环）对应于PKBα的461-480个残基，其中Ser473被磷酸化；肽HM-PKBα（闭合圈）对应于包含PKBα残基461-480的非磷酸化肽。PRK2衍生肽PIFtide先前被表征为与PDK1上的PIF结合口袋特异性相互作用（Biondi等., 2000). 数据是从一个具有代表性的实验中进行的单次测定，该实验至少重复了两次，结果相似。
无
图7。AGC激酶疏水基序互换的效果。编码指示野生型和突变型PKBα的GST融合蛋白(A类和B类)和SGK1(C类)其结构如图1所示，在293个细胞中表达。隔夜剥夺细胞的血清，然后不刺激或用100 ng/ml IGF1刺激细胞10分钟（B）或15分钟（C）。对细胞进行裂解，并在谷胱甘肽-Sepharose上纯化GST融合蛋白亲和力。在4–12%SDS–聚丙烯酰胺凝胶上电泳0.5µg的每个蛋白质样品，并使用识别PKBα（A和B）或SGK1（C）在其T环残基（即Thr308和Thr256）磷酸化的磷酸特异性抗体进行免疫印迹。凝胶也用考马斯染色，以确保GST-ΔPH-PKBα融合蛋白的负载量相似。每种GST融合蛋白激酶（50 ng）的比活性通过其磷酸化肽底物交叉肽（GRPRTSSFAEG）的能力进行评估，如材料和方法中所述。显示了单个实验的结果，在（a）的三个单独实验和（B和C）的两个实验中获得了类似的结果。
无
图8。PDK1专用于识别S6K、SGK和PKB的模型。(A类)PDK1的结构域结构表明PIF-结合囊位于激酶结构域的小叶上。(B类)PDK1可以识别、相互作用然后磷酸化S6K和SGK的模型概述。在此模型中，PtdIns（3,4,5）P三调节磷酸化S6K1和SGK1的未知疏水基序（HM）激酶的活性，从而触发与PDK1的PIF-结合囊的对接。(C类)相反，PDK1的PIF-结合囊不参与PDK1与PKB的结合。相反，这是PKB和PDK1的PH结构域与PtdIns（3,4,5）P的相互作用三将PKB和PDK1结合在一起。
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